所选化合物影响瘤胃发酵和甲烷生成的体外评价

《Journal of Dairy Science》：In vitro evaluation of selected compounds affecting ruminal fermentation and methane production

　　

瘤胃发酵产生挥发性脂肪酸（VFA）供宿主代谢，但也产生甲烷（CH₄），一种与日粮能量损失相关的气态副产物。饲料添加剂如硝基化合物和植物化学物质可减少CH₄排放；然而，它们也可能损害VFA合成，因此在体内应用前需仔细评估。为解决此问题，研究人员进行了3个连续的体外试验，旨在：i) 筛选11种化合物的甲烷减排潜力，包括硝基化合物、植物次生化合物和植物化学物质；ii) 确定在不影响VFA产量的前提下促进CH₄减少的最小有效剂量（0、1.25、2.5、5和10 mM）；以及iii) 评估香芹酚（CAR）和2-硝基乙醇（2NEOH）在低剂量（各1.25 mM）和高剂量（各2.5 mM）下对瘤胃发酵参数（包括pH、体外干物质消化率（IVDMD）、VFA谱、气体产量（CH₄、CO₂、H₂）和发酵动力学）的联合效应。在筛选的11种化合物中，包括CAR和2NEOH在内的4种处理显著减少了CH₄产量至少20%，并被选用于评估。增加剂量水平，尤其是CAR，显著降低CH₄，但也对VFA产量产生负面影响。在组合阶段，高剂量组合几乎消除了CH₄产量，但总VFA减少了约50%，并增加了H₂积累，表明微生物发酵整体减少而非产甲烷作用被靶向抑制。低剂量组合降低了乙酸浓度，从而降低了乙酸与丙酸的比例和H₂积累。CH₄减少（18%）和丙酸的适度增加与对照组无显著差异（P > 0.05）。研究人员的发现表明，CAR和2NEOH对瘤胃发酵和产甲烷作用发挥不同的作用。值得注意的是，高剂量组合对发酵参数产生负面影响，而低剂量组合的表现与单独使用2NEOH相似。进一步研究这些化合物如何调节瘤胃微生物群将有助于阐明其差异作用机制，之后才可在体内进行测试。

**论文解读：硝基化合物与植物化学物质对瘤胃发酵和甲烷生成的体外评价**

**研究背景与目的**
反刍动物依赖瘤胃微生物发酵将植物生物质转化为挥发性脂肪酸（VFA），满足其约70%的日常能量需求。然而，该过程同时产生甲烷（CH₄），一种导致2–12%总能损失的温室气体，且通过嗳气排放。目前，减少瘤胃甲烷生成的策略包括遗传选育、日粮调整和饲料添加剂。其中，饲料添加剂因易于整合和快速生效而备受关注，例如硝基化合物3-硝基氧丙醇（3-NOP）通过抑制甲基辅酶M还原酶（MCR）直接抑制产甲烷，但存在经济回报下降的问题。植物化学物质如精油、多酚和皂苷则通过影响底物供应间接减少甲烷，但其效果变异大，且可能降低总VFA浓度。目前，对这两类化合物联合作用的研究尚不充分。因此，本研究旨在通过3个连续体外试验，筛选具有甲烷减排潜力的化合物，确定最低有效剂量，并评估香芹酚（CAR）与2-硝基乙醇（2NEOH）单独及联合使用的效果，以探索在不损害发酵效率的前提下实现甲烷减排的可行策略。该论文发表在《Journal of Dairy Science》。

**主要关键技术方法**
研究采用三个连续体外发酵试验：筛选阶段评估4种硝基化合物和7种植物化学物质（纯度>98%）对瘤胃pH、VFA及气体（CO₂、CH₄、H₂）的影响；剂量-效应阶段对筛选出的化合物（CAR、NE、2NEOH、NEPOH）设定0–10 mM梯度浓度，评估最低有效剂量；组合阶段将CAR和2NEOH以低浓度（各1.25 mM）和高浓度（各2.5 mM）联合，利用ANKOM RF气体生产系统监测气体动力学，并分析体外干物质消化率（IVDMD）。瘤胃液取自2头瘘管奶牛（泌乳中期，日粮配方详见表S1），每个试验设2个独立批次，每处理3个重复瓶。气体浓度通过气相色谱分析，VFA通过高效液相色谱（HPLC）测定，数据采用线性或广义线性混合模型分析。

**研究结果**
**筛选阶段**：对11种化合物的评估显示，pH、总VFA、乙酸、丙酸及气体谱变化显著（P < 0.001）。与对照组相比，CAR、2NEOH、NE和NEPOH显著提高pH，而CA、COU、FLA、TA和VA降低pH。CAR、NE和NEPOH使总VFA分别降低57%、51%和27%；乙酸分别降低66%、51%、41%和31%（NE、CAR、NEPOH、2NEOH）。CH₄浓度减少97%（2NEOH）、90%（CAR）、95%（NE）和44%（NEPOH）。H₂浓度在硝基化合物和CA处理组中显著升高，NE和2NEOH的H₂水平分别增加约954倍和1163倍。仅CAR、2NEOH、NE和NEPOH实现至少20%的CH₄减少，进入下一阶段。

**剂量-效应阶段**：CAR表现出线性剂量效应，5 mM时CH₄和乙酸分别减少87%和42%，H₂浓度翻倍，但丙酸在2.5 mM时降低60%，表明微生物发酵整体受抑。2NEOH在2.5 mM时减少CH₄ 40%，5 mM时减少80%，伴随H₂增加和丙酸升高（2.5 mM提升26%，5 mM提升35%），乙酸与丙酸比降低，且总VFA未受影响。NE在2.5 mM时显著降低CH₄，但乙酸减少仅在高浓度（5–10 mM）出现，丙酸无显著变化。NEPOH在10 mM时CH₄减少26%，效果最弱。基于此，2NEOH和CAR被选为组合阶段候选物。

**组合阶段**：单独使用CAR（2.5 mM）和2NEOH（2.5 mM）分别使CH₄减少57%；高浓度组合（HIGH，各2.5 mM）使CH₄减少95%，但总VFA降低约50%，IVDMD降低17.4%，H₂大幅积累，表明微生物发酵整体受抑而非靶向抑制产甲烷。低浓度组合（LOW，各1.25 mM）使CH₄减少18%（未达统计显著），乙酸降低22%，丙酸无变化，乙酸与丙酸比降低25%，H₂积累与单独2NEOH类似。气体动力学分析显示，HIGH处理的气体渐近产量（系数a）降低43.4%，最大气体产生速率（TMPG）降低61.9%，拐点时间（HPI）延长141%，表明发酵显著减缓。CAR与2NEOH的联合未产生预期协同效应。

**讨论与结论**
讨论指出，CAR的强抗菌活性（破坏细胞膜、抑制ATP合成）导致微生物发酵广泛抑制，CH₄降低间接源于底物供应减少，这在低剂量时无效、高剂量时损害消化率。2NEOH则通过下调mcrA基因表达直接抑制产甲烷，同时促进丙酸生成，改善能量利用效率。HIGH联合剂量虽大幅减少CH₄，但发酵参数恶化，表明H₂积累超出微生物替代电子汇能力；LOW剂量效果主要来自2NEOH，未体现协同作用。结论部分翻译如下：研究人员的发现表明，CAR和2NEOH对瘤胃发酵和产甲烷作用具有不同影响。CAR的强抗菌活性呈剂量依赖性，导致发酵产物、总气体产量和消化率显著降低，其CH₄减少主要源于整体发酵抑制，限制了高浓度精油的应用；相比之下，2NEOH在维持发酵的同时降低产甲烷并适度增加丙酸，更适合体内研究。将CAR和2NEOH以两种浓度联合未产生预期协同效应：高浓度组合加剧发酵抑制作用，低浓度组合未能改善结果。因此，初始假设（协同作用）未被支持。未来需通过体内研究评估2NEOH作为独立策略在奶牛中的效果，而CAR或其结构类似物需更多体外研究后再行体内试验。