采用Psidium guajava（番石榴）水提取物和常规电解液阳极氧化的钛种植体体外生物学评价

《International Journal of Biomaterials》：In Vitro Biological Evaluation of Titanium Implants Anodized With Aqueous Extract of Psidium guajava and Conventional Electrolytes

　　

钛种植体可能释放离子而损伤细胞。阳极氧化可在表面形成保护性氧化层，但常规酸法存在环境与安全顾虑。本研究评估了采用Psidium guajava水叶提取物(PgE)作为钛板阳极氧化电解质的替代方案，对其体外细胞毒性和骨结合的影响。为此，研究人员将1 cm2钛板分别在H3PO4、H3PO4+HF或PgE中阳极氧化，各分组评估其对骨肉瘤(Saos-2)细胞和成纤维(NIH-3T3)细胞活力、黏附和增殖的影响。板表面通过能量色散X射线光谱(EDS)、X射线衍射(PXRD)和静滴法接触角测量进行表征，结果表明PgE阳极氧化板亲水性更高。细胞毒性通过间接法（提取培养基）和直接法（细胞直接接种于钛板）评估；24 h和96 h后通过MTT法和中性红摄取(NRU)法测定细胞活力。骨结合通过DAPI染色计数细胞核分析增殖，通过扫描电子显微镜(SEM)观察黏附。间接法中所有样品与对照组相比无显著差异(ANOVA/Tukey检验；p＜0.05)；直接法显示所有阳极氧化板平均细胞活力升高。H3PO4和PgE板的两种细胞系细胞核数均较纯钛增加。SEM分析揭示H3PO4或PgE阳极氧化表面细胞形态改善、黏附增强，而H3PO4+HF组细胞较薄、铺展较差，提示细胞锚定受损。结果表明PgE用作钛板阳极氧化电解质无细胞毒性，可增强细胞增殖与黏附，优于常规H3PO4+HF电解质，是契合绿色化学原则的具前景的可持续替代方案。

该研究论文发表于《International Journal of Biomaterials》。研究背景方面，钛种植体在临床中广泛应用，但金属植入体在生物环境中可能发生腐蚀并释放离子损伤周围组织，因此需通过表面处理增厚TiO₂层以提升耐久性并改善生物性能。阳极氧化是常用方法，可在钛表面形成粗糙且亲水的氧化层，促进细胞黏附与增殖，但常规电解液如磷酸(H₃PO₄)和氢氟酸(HF)存在毒性和环境风险。为寻求更安全可持续的替代方案，研究人员提出以Psidium guajava（番石榴）水叶提取物(PgE)作为绿色电解液，其酚类衍生物可在电化学过程中起氧化剂作用，且已有报道PgE对某些肿瘤细胞有抑制作用同时对正常成纤维细胞无毒性。因此本研究旨在比较PgE与传统酸电解液阳极氧化钛板在两株细胞模型中的相互作用、细胞毒性、细胞黏附与骨结合相关表现，为后续体内应用提供依据。

关键方法上，研究人员将2级商用纯钛板切割为1 cm×1 cm×1 mm试样，分为四组：未处理纯钛、H₃PO₄阳极氧化、H₃PO₄+HF阳极氧化、PgE阳极氧化；阳极氧化均在15 V恒压15 s条件下进行，PgE由巴西南部采集的番石榴成熟叶经烘干、粉碎、热水提取、过滤制得；表面表征采用能量色散X射线光谱(EDS)、粉末X射线衍射(PXRD)、静滴法接触角测量（模拟体液SBF为液相）及扫描电子显微镜(SEM)；细胞实验使用Saos-2（人骨肉瘤细胞系）和NIH-3T3（小鼠胚胎成纤维细胞系），来自里约热内卢细胞库(BCRJ)；细胞毒性评价包括间接法（获取100%、75%、50%提取培养基作用于已汇合细胞，MTT法与中性红摄取(NRU)法检测24 h与96 h活力）与直接法（细胞直接接种于固定在24孔板的钛板上，NRU法测24 h与96 h活力）；骨结合评价通过DAPI染色计数96 h后细胞核数反映增殖，通过SEM观察96 h后细胞形态与黏附；统计采用Shapiro–Wilk正态性检验与单因素ANOVA加Tukey事后检验，p＜0.05为显著。

3.1. Titanium Anodization（钛阳极氧化）：研究人员通过目视观察和电流密度-时间曲线分析发现，三种阳极氧化试样均呈铜色调，表明氧化层形成；PgE为黄褐色但样品显色源于光干涉效应而非电解质本色；电流密度瞬态显示H₃PO₄组初始峰值最高(~0.14 mA/cm²)，PgE居中(~0.10 mA/cm²)，H₃PO₄+HF最低(~0.07 mA/cm^{2)；H₃PO₄+HF因HF导致氧化膜形成-溶解过程而峰值较低，PgE中间峰值提示可能形成多孔氧化层，电流衰减较缓支持多孔结构形成。}

3.2. Characterization of the Anodized Layer Surface（阳极氧化层表面表征）：EDS与PXRD均未检测到含磷相，2.12 keV峰来自制样镀金层，所有样品衍射峰以六方密排金属钛为主，表明氧化膜多数为非晶或低结晶度；接触角测量显示纯钛为77.87°±0.50°，H₃PO₄组83.20°±0.35°，H₃PO₄+HF组86.27°±0.51°，均更疏水，而PgE组仅51.9°±0.56°，亲水性显著提高；SEM表明H₃PO₄+HF组平均孔径最大(1.7±0.9 μm²)，H₃PO₄组次之(1.1±1.15 μm²)，PgE组孔径最小且均匀(0.62±0.20 μm²)；培养液孵育后孔结构被吸附蛋白/盐类部分掩盖；PgE的氧化机制主要归因于酚类化合物提供–OH与钛表面作用生成TiO₂层，电解质中少量磷酸(189.5±35.15 mg/L)也可能参与。

3.3. Cytotoxicity（细胞毒性）：间接MTT法显示各提取培养基（100%、75%、50%）在所有时间点两细胞系中活力均＞90%，无组间显著差异，符合ISO 10993-5非细胞毒性标准（≥70%）；间接NRU法同样显示各组成活率≥100%，部分组在24 h略高但96 h趋近对照；直接NRU法显示所有阳极氧化组两细胞系在24 h和96 h活力均高于纯钛（平均提升约25.7%），如Saos-2在96 h时PgE组达120% vs纯钛99%，NIH-3T3在96 h时PgE组142% vs纯钛97%；统计表明阳极氧化普遍提升直接接触下的细胞活力且无毒性。

3.4. Cell Adhesion and Proliferation（细胞黏附与增殖）：SEM观察发现NIH-3T3在H₃PO₄+HF组细胞较薄、铺展差，暗示黏附受损；H₃PO₄与PgE组细胞形态正常、有胞质突起、增殖良好；Saos-2在PgE组细胞紧密接触、铺展平滑、覆盖基板好，在未处理及酸阳极氧化组则膜突起不规则、细胞间距大、基板裸露较多；DAPI核计数显示96 h时NIH-3T3核数较纯钛增加：H₃PO₄组84.4%，H₃PO₄+HF组64%，PgE组99.7%（PgE比H₃PO₄+HF高35.7%）；Saos-2核数增加：H₃PO₄组42%，PgE组71.6%（PgE比H₃PO₄+HF高32.9%，H₃PO₄+HF vs纯钛无显著提升）；表明PgE阳极氧化促进两细胞系增殖与黏附，效果优于或与H₃PO₄相当，而H₃PO₄+HF对Saos-2黏附改善有限。

讨论部分总结：研究人员指出三种阳极氧化均形成均匀氧化膜，无细胞毒性且提升细胞黏附与增殖；H₃PO₄和PgE阳极氧化显著提高细胞密度、铺展与细胞间接触，骨结合指标更优；H₃PO₄+HF组细胞黏附相对较弱，接近纯钛；PgE作为替代电解液无细胞毒性且促进细胞增殖黏附，是具前景的创新金属表面改性途径；但仍需体内研究完善对骨结合、生化标志物及炎症反应的认知以确认临床应用潜力。结论部分译为：本研究中，采用H₃PO₄、H₃PO₄+HF或PgE阳极氧化的钛板产生均匀氧化膜；这些阳极氧化板不诱导细胞毒性并促进增强的细胞黏附与增殖；阳极氧化显著改善骨结合关键指标，在H₃PO₄和PgE阳极氧化钛板上获得更高细胞密度，以及更广泛细胞铺展和更紧密细胞间接触；相比之下，H₃PO₄+HF阳极氧化板表现出相对较弱的细胞黏附，类似于纯钛；这些发现表明PgE用作钛板替代电解液无细胞毒性同时促进细胞黏附与增殖，代表一种具前景且创新的金属表面改性途径；然而需要体内研究来深化对骨结合的理解并评估生化标志物和炎症反应，以确认其临床应用潜力。