《Journal of Hand Therapy》：Unveiling the Neurotoxic Mechanism of Amino-Functionalized Graphene Quantum Dots: Mitophagy-Driven Ferroptosis Underlies Progressive Anxiety-like Behaviors
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范丽凡|刘玉彤|马楠欣|王瑞|王文豪|张琪月|任志华|宁霞|库婷婷中国山西省太原市山西大学环境与资源学院环境与健康研究中心，基于煤炭的新兴污染物识别与风险控制山西省重点实验室，邮编030006摘要氨基功能化的石墨烯量子点（A-GQDs）是一种新兴的环境污染物，但其发育过程中的神经
范丽凡|刘玉彤|马楠欣|王瑞|王文豪|张琪月|任志华|宁霞|库婷婷
中国山西省太原市山西大学环境与资源学院环境与健康研究中心，基于煤炭的新兴污染物识别与风险控制山西省重点实验室，邮编030006
摘要
氨基功能化的石墨烯量子点（A-GQDs）是一种新兴的环境污染物，但其发育过程中的神经毒性尚未得到充分了解。本研究表明，A-GQDs（<10纳米）会在斑马鱼脑组织中积累，引发持续至少14天的类似焦虑和攻击性行为。为阐明其潜在机制，我们采用双向方差分析（ANOVA）研究了发育阶段与A-GQDs暴露之间的相互作用。随后通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别出一个同时富集于线粒体自噬和铁死亡途径的基因模块。对两个时间点共表达差异基因的基因本体论（GO）分析进一步发现，与线粒体呼吸链复合体组装、线粒体自噬和铁离子稳态相关的过程显著富集。机制上，A-GQDs诱导线粒体功能障碍，激活PINK1/parkin介导的线粒体自噬，从而破坏铁离子稳态并触发铁死亡。重要的是，抑制任一途径均可缓解行为缺陷，这验证了线粒体-线粒体自噬-铁死亡轴是A-GQDs神经毒性的核心机制。这些发现揭示了一种涉及A-GQDs的新神经毒性途径，并强调了将基于机制的终点纳入纳米材料风险评估框架的紧迫性，以增强我们对它们对环境和公共健康潜在影响的理解。
引言
石墨烯量子点（GQDs）因其出色的光热稳定性、可调的光致发光、高光电灵敏度和良好的生物相容性，在生物医学、催化、传感器和有机光伏领域引起了广泛关注[1]、[2]。这种需求的增长推动了全球产量的大幅增加，目前GQDs市场的价值为68亿美元，预计2025年至2035年间年增长率约为22.0%[3]。然而，这种快速扩张也引发了关于GQDs环境释放的担忧，尤其是在电子废物处理和工业废水处理过程中[4]。例如，污水处理厂进水中的GQDs浓度估计在10至100纳克/升之间，特别是在电子制造和纳米材料生产密集的地区[3]。由于天然水体中GQDs的直接监测数据有限，其环境存在主要基于现有估计和相关石墨烯基纳米材料推断得出。这些估计表明，GQDs残留物可能在低环境浓度下存在，而根据氧化石墨烯相关模型预测的环境最高水平可能接近1毫克/升[5]。除了背景环境存在外，GQDs在环境修复和水处理系统中通常以相对较高的浓度（≥10毫克/升）使用以实现功能性能。在这些应用中，它们与废水的直接接触可能会产生局部高暴露情况，增加对水生生物的潜在风险[6]。因此，GQDs的环境释放和应用引发了对其通过直接暴露或食物链传递对水生生物和人类健康潜在影响的担忧，突显了更好地理解其在生物体内生物效应的必要性。
在各种类型的GQDs中，氨基功能化的石墨烯量子点（A-GQDs）已成为环境关注的焦点。这些表面工程化的A-GQDs虽然通过生物分子偶联实现了精确的药物递送优势，但反而促进了持续的神经元内化[7]、[8]。据报道，A-GQDs通过钙调节紊乱、DNA损伤、细胞周期停滞和GABA能系统破坏引发神经毒性[9]。然而，之前的纳米毒理学研究主要集中在暴露期间的毒性反应，而暴露后的结果，包括毒性的可逆性和持久性，仍较少系统地被研究[10]、[11]。现有证据并不一致，一些研究报道颗粒清除后DNA修复反应的激活[12]，而其他研究则描述了持续效应，如斑马鱼中的石墨烯生物积累和器官特异性DNA甲基化改变[13]。这些发现强调了确定在关键发育窗口期间的短期暴露是否会导致暴露停止后的持续神经功能障碍，以及哪些分子途径可能维持这种效应的必要性。
新兴的学术讨论开始围绕这样一个观点：纳米颗粒引起的神经毒性可能与两个关键细胞途径密切相关：铁死亡，这是一种由脂质过氧化驱动的铁依赖性细胞死亡方式[14]，以及线粒体自噬，即受损线粒体的选择性自噬降解[15]。这两种机制在纳米材料背景下尤为重要，因为它们倾向于通过芬顿反应扰乱铁离子稳态并破坏线粒体膜完整性[16]、[17]。这种细胞内定位被认为通过诱导线粒体去极化来引发线粒体自噬，同时耗尽谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），这是铁死亡的关键抑制剂[18]、[19]、[20]。尽管在这些理解方面取得了进展，但我们的知识仍存在一个关键空白：A-GQDs暴露是否通过在水生生物中持续激活铁调节紊乱和线粒体质量控制途径来引发渐进性神经损伤的问题，在纳米颗粒清除后的环境相关恢复阶段仍存在不确定性。
为了解决这些问题，我们建立了一个斑马鱼“暴露-恢复”模型，将幼鱼从受精后2小时（hpf）暴露于A-GQDs，直到受精后7天（dpf），随后进行清水监测直至21 dpf。该设计使我们能够确定早期A-GQDs暴露是否会在暴露停止后引发持续的神经行为缺陷，并阐明线粒体功能障碍、线粒体自噬激活和铁死亡相关途径是否对长期神经毒性有贡献。进一步的整合转录组学和表型分析用于识别恢复期间与持续神经毒性相关的分子事件。
章节片段
A-GQDs的物理化学特性
本研究中使用的A-GQDs购自中国西安的瑞熙纳米技术有限公司，并制备成10毫克/毫升的水溶液。通过高分辨率透射电子显微镜（JEM-F200，200千伏）检查其形态，样品沉积在碳涂层铜网格上并风干。使用Zetasizer Nano ZS系统（Malvern Instruments，英国）测量了Zeta电位、流体动力学直径和多分散指数（PDI），并分析了表面元素组成和化学性质
A-GQDs的特性及其发育毒性的评估
TEM显示A-GQDs具有球形形态，平均直径小于10纳米（图S2A）。物理化学特性分析表明，水溶液中的A-GQDs具有2.0 ± 0.7毫伏的Zeta电位，239.3 ± 29.8纳米的流体动力学直径，以及0.19 ± 0.10的多分散指数（图1A），表明其具有中等程度的胶体分散性。XPS确认合成的A-GQDs主要由碳、氮和氧组成，其光谱特征与先前的报告一致（图1
结论
本研究表明，胚胎期A-GQDs暴露会在斑马鱼中引发持续的焦虑和攻击性行为，这种行为在清水恢复后持续14天。转录组学和药理学分析揭示，这种持久的神经毒性是由线粒体自噬-铁死亡轴驱动的，其中A-GQDs引发持续的铁调节紊乱和脂质过氧化，同时线粒体损伤激活PINK1/PARKIN线粒体自噬。关键的是，过度的线粒体自噬会加剧铁死亡
环境影响
本研究表明，作为新兴的环境污染物，氨基功能化的石墨烯量子点（A-GQDs）会在斑马鱼中引发类似焦虑和攻击性行为，这些行为在短期早期暴露后持续至21 dpf。机制上，A-GQDs引发线粒体功能障碍和线粒体自噬-铁死亡途径的激活，这可能有助于暴露停止后的持续神经毒性。这些发现表明，在
CRediT作者贡献声明
王文豪：可视化。王瑞：数据管理。马楠欣：软件、方法学。刘玉彤：可视化、数据管理。范丽凡：撰写——初稿、验证、数据管理、概念化。任志华：正式分析。张琪月：正式分析。库婷婷：撰写——审稿与编辑、监督、资源、方法学。宁霞：资源。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFC3708305）和中国国家自然科学基金（编号22176119、22376130和22306115）的支持。
注释
没有需要披露的潜在利益冲突。
支持信息。。RT-qPCR引物表（表S1）；WGCNA识别的蓝色模块中603个基因显著富集的KEGG途径（p < 0.05）（表S2）；GSEA结果
