通过协同代谢和微环境调控构建用于分解联苯菊酯的合成微生物群落

《Journal of Hazardous Materials》：Construction of a Synthetic Microbial Consortium for Bifenthrin Biodegradation via Cooperative Metabolism and Microenvironment Modulation

　　

作者：华南夏、陈克金、陈瑶、郑元林、张莉兰

教育部三峡库区生态环境重点实验室，重庆大学，重庆，400045，中国

摘要

联苯菊酯是一种高毒性和持久性的拟除虫菊酯类杀虫剂，其残留物威胁着生态系统的安全与人类健康。尽管微生物修复是一种有前景的策略，但单个菌株的降解效率常常受到中间产物联苯菊酯醇的空间位阻限制。在本研究中，从受污染的土壤中分离出了铜绿假单胞菌（PA）菌株和广养副球菌（PP）菌株，并将它们构建成一个合成联合体（PA+PP），该联合体显著增强了联苯菊酯的降解能力。该联合体的降解速率常数明显高于任一单独菌株（k₃ = 0.26 d^-1 > k₁ = 0.15 d^{-1 > k₂ = 0.10 d-1）。在优化的实验条件下，联苯菊酯以100 mg/L的初始浓度加入含有0.1% Tween 80的水基MSM体系中，7天内实现了92.38%的去除率。机制分析表明：PA作为水解剂，裂解联苯菊酯的酯键生成联苯菊酯醇和三氟氯菊酸；而PP作为氧化剂，有效降解了联苯菊酯醇，从而缓解了对PA水解酶的空间位阻，并建立了必要的协同降解伙伴关系。此外，PA分泌的胞外聚合物物质（EPS）富含多糖、蛋白质和类腐殖质成分，促进了联苯菊酯的吸附和电子转移，优化了局部微环境，增强了协同作用。本研究揭示了PA和PP之间之前未报道的协同机制，为设计有效的微生物联合体以修复联苯菊酯污染提供了理论基础。这些发现有助于提高联苯菊酯及其他拟除虫菊酯的微生物降解效率，为开发用于环境生物修复的工程菌剂提供了理论支持。}

引言

联苯菊酯是一种广用于农业和城市害虫控制的代表性拟除虫菊酯类杀虫剂，因其高效性和广谱活性而受到青睐[56]。美国注册审查文件显示，2014至2018年间，其农业年使用量约为100万磅，处理面积每年超过1400万英亩[19]。在农业环境中，联苯菊酯可通过降雨或灌溉引起的地表径流进入沟渠、河流和湖泊[53]。由于其疏水性和对土壤及有机物的强吸附性，它还会随侵蚀的沉积物和悬浮颗粒物进入接收水体[21]。城市雨水以及受城市影响的河流和溪流中的联苯菊酯浓度可达9.9–120 ng/L[5]。一旦进入地表水，联苯菊酯对水生无脊椎动物具有高度毒性，无论是急性还是慢性暴露都会对其造成伤害[33]，短期暴露还会影响底栖和浮游生物的行为并导致死亡，降低生物多样性和生态系统功能[2][53]。关键功能基团的抑制可能通过食物网传播并重塑群落结构，影响整个生态系统[44]。世界卫生组织（WHO）将联苯菊酯归类为II类（中等危害），因此不应忽视其对人类健康的潜在风险[54]。鉴于其广泛使用和在环境中的高迁移及积累倾向，迫切需要筛选能够高效降解联苯菊酯的微生物菌株。

在这种背景下，利用微生物的代谢活性进行生物修复是一个有前景的解决方案。多种本土或适应性的假单胞菌、芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌在广泛的pH值、盐度和有机物条件下均表现出高效的拟除虫菊酯降解能力[18][36][9]。然而，联苯菊酯的降解动力学通常比其他拟除虫菊酯慢[8]。尽管许多微生物可以降解联苯菊酯，但它们的降解效果往往不如其他拟除虫菊酯，即使在同一菌株内也是如此[7]。例如，铜绿假单胞菌 JQ-41对芬普罗帕丁、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率约为90%，而对联苯菊酯的降解率仅为70.1%；而苏云金芽孢杆菌 ZS-19对多种拟除虫菊酯的降解率超过90%，但对联苯菊酯的降解率仅为50.9%[47][6]。基于产品的分析表明，联苯菊酯首先经历羧基酯键的水解，生成三氟氯菊酸和联苯菊酯醇[10]。其相对较慢的降解速率可能源于：(i) 联苯菊酯醇的空间位阻阻碍了酶与底物的结合；(ii) 与许多拟除虫菊酯中的苯氧基中间体相比，联苯菊酯醇中间体对氧化和环裂解的抵抗力更强[49]。

为了解决有毒中间产物积累的问题，基于协同降解构建合成微生物联合体是一种可行的策略。将“上游水解剂”与“下游氧化剂”配对可以持续消耗中间产物，限制代谢产物的积累和反馈抑制，增强解毒作用[28]。对于其他拟除虫菊酯，蜡样芽孢杆菌 ZH-3和金黄色链霉菌 HP-S-01的共培养显著提高了氰戊菊酯的降解效率，其在纯培养中的半衰期从32.6–43小时缩短至混合培养中的13小时[11]。这些结果表明，代谢互补性可以带来协同降解优势[3]。然而，迄今为止，这种联合体在联苯菊酯修复中的应用及其醇中间体的降解机制仍需进一步探索。

此外，共培养并不总是具有协同效应[42]。当两种菌株在底物利用上重叠或占据相似生态位时，可能会发生竞争或拮抗[45]。环境条件会影响这种平衡：在较高初始浓度下，联苯菊酯的抑制作用更强，且降解通常在接近中性的pH值下表现最佳[15]。虽然易吸收的碳源可以促进生长，但它们可能通过酸化介质或代谢抑制作用抑制拟除虫菊酯的转化[35]。因此，在不利条件下，协同效应可能会减弱或逆转，需要严格优化。

基于这一原理，从农药污染的土壤中分离出六种菌株，鉴定为肺炎克雷伯菌（KP）菌株、广养副球菌（PP）菌株、铜绿假单胞菌（PA）菌株、坚强芽孢杆菌（BF）菌株、醋酸钙不动杆菌（AC）菌株和地衣芽孢杆菌（BL）菌株。筛选结果显示，PP在MSM中的降解效率最高，而PA在添加蛋白胨或葡萄糖的MSM中表现最佳。这表明PA主要通过水解作用降解联苯菊酯，而PP则依赖氧化作用。基于这种互补性，我们构建了一个合成联合体（PA+PP）以克服酶的空间位阻和生物降解不足的问题。我们假设存在一种协同降解伙伴关系：PA通过酯键水解启动降解，而PP则氧化抑制性的联苯菊酯醇。因此，本研究的目标是：(1) 在受控条件下阐明联合体系统中实现协同降解的基本机制，排除环境干扰；(2) 评估该复合培养在环境修复中的理论应用潜力。

章节片段

化学物质和培养基组成

乙腈（HPLC级）购自成都科隆化工有限公司（中国成都）。联苯菊酯（纯度98%）购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。联苯菊酯醇（纯度98%）购自上海麦克林生化有限公司（中国上海）。矿物盐培养基（MSM）购自北京酷拉贝尔科技有限公司（中国北京）。Luria–Bertani（LB）培养基购自青岛

双菌株联合体表现出增强的协同降解动力学

图1a展示了PA、PP及PA+PP联合体降解联苯菊酯的动力学模型拟合结果。动力学分析表明，PA、PP和PA+PP系统的降解均符合一级动力学，所有模型的R²值均大于0.90。PA、PP和PA+PP系统的一级速率常数分别为0.15、0.10和0.26 d^-1，表明PA+PP系统的降解速率高于单独的PP系统

结论

本研究成功构建了由铜绿假单胞菌（PA）和广养副球菌（PP）组成的合成微生物联合体，用于高效降解难降解的联苯菊酯。在优化条件下（pH 7.27、31.23°C、接种量6.22%），PA+PP联合体在7天内实现了92.38%的降解率，表现出0.26 d^-1的协同一级速率常数。这种增效效果源于明确的代谢作用特异性。

环境影响

联苯菊酯是一种有毒且持久的杀虫剂，对环境构成风险。本研究表明，合成微生物联合体克服了单菌株生物降解的局限性。铜绿假单胞菌可水解联苯菊酯，而广养副球菌可快速氧化其有毒中间产物。细菌生物膜进一步增强了降解效果。这项工作为设计用于修复联苯菊酯和其他持久性污染物的联合体提供了基础。

作者贡献声明

张莉兰：撰写 – 审稿与编辑、验证、项目管理、资金获取、数据管理、概念构思。郑元林：软件、资源、方法学。陈瑶：软件、方法学、实验研究。陈克金：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、实验研究。华南夏：撰写 – 初稿撰写、软件使用、资源管理、方法学、实验研究、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了重庆市技术创新与应用发展重点项目（CSTB2023TIAD-KPX0071）和中国国家自然科学基金（42522712；42377387）以及重庆市投资集团创新项目（SJPPP-2024-025）的财政支持。