神经元兰尼碱受体2(RyR2)的簇集特性及在阿尔茨海默病APP/PS1小鼠模型中的纳米尺度重构

《Acta Physiologica》：Clustering Properties of Neuronal Ryanodine Receptor 2 and Remodeling in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease

　　

目的：兰尼碱受体2(Ryanodine Receptor 2, RyR2)是介导多种组织细胞内Ca2+释放的通道，其活性失调导致病理性Ca2+释放及细胞信号紊乱。在心肌中RyR2形成离散纳米簇及钙释放单元(calcium release units, CRUs)，并在心力衰竭等病理状态下发生纳米尺度重构，但神经元中是否存在类似RyR2簇及CRUs尚不清楚。方法：研究人员采用超分辨成像(direct stochastic optical reconstruction microscopy, dSTORM)评估野生型小鼠海马CA1锥体神经元中RyR2的空间组织形式，并利用阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的APP/PS1小鼠模型评估与神经元病理性Ca2+释放相关的RyR2纳米尺度重构。结果：研究人员首次鉴定并详细表征了中枢神经元中存在与心肌类似的RyR2离散纳米簇；在伴有高淀粉样斑块负荷及认知缺陷年龄的AD小鼠CA1神经元中，观察到RyR2簇面积减小及CRU组织程度降低，此重构类似于心脏病理状态下的改变。结论：上述发现提示神经元RyR2簇及CRUs的纳米尺度重构是AD中Ca2+通道失调及神经元功能障碍的新机制。

论文解读：神经元Ryanodine Receptor 2(RyR2)簇的纳米尺度特性及APP/PS1阿尔茨海默病小鼠模型中的重构

研究背景与立项依据

Ryanodine Receptor 2（RyR2，一种Ca²⁺敏感的细胞内Ca²⁺释放通道）广泛分布于心肌和内质网/肌浆网（Endoplasmic/Sarcoplasmic Reticulum, ER/SR）膜上，调控基本细胞功能。在脑内，神经元RyR2参与突触传递、可塑性及固有兴奋性，并与学习记忆密切相关；其在阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）中被认为与病理性胞内Ca²⁺释放及神经元功能紊乱有关。在心脏研究中已证实RyR2于心肌细胞形成离散纳米尺度簇（clusters），相近簇（间距＜150 nm）构成功能性耦联的钙释放单元（Calcium Release Units, CRUs，亦称super-clusters），且此种纳米排列的重构与心力衰竭时的病理性Ca释放相关。然而，中枢神经系统神经元中RyR2是否也组装成类似心肌的纳米簇及CRUs、是否发生疾病相关性纳米重构，此前未见报道。鉴于AD与心衰均存在RyR2功能亢进导致的细胞兴奋性增高，研究人员假设神经元RyR2可能采取与心肌相似的纳米组织结构，且该结构在AD中发生病理性重构，进而参与神经元Ca²⁺稳态失衡。本研究旨在利用超分辨成像技术在体鉴定海马CA1锥体神经元胞体RyR2纳米簇及CRUs，并在APP/PS1双转基因AD小鼠模型中评估其纳米尺度改变。

主要关键技术方法

研究人员取9月龄雌性野生型（Wild-Type, WT）及APP/PS1双转基因（表达人APPswe及PS1ΔE9，即AD模型）C57BL/6J小鼠，灌注固定后制备背侧海马冰冻切片。采用免疫荧光标记RyR2、神经元核抗原（Neuronal Nuclei, NeuN）及微管相关蛋白2（Microtubule-Associated Protein 2, MAP2），借助共聚焦及直接随机光学重建显微术（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, dSTORM）获取海马CA1区图像。利用自定义Python显微环境软件（PyME）及ImageJ进行胞体RyR2簇分割、面积计算、最近邻距离（Nearest Neighbor Distance, NND）测定及CRU判定（簇心边缘距＜150 nm归为同一CRU）。全海马组织行Western Blot检测RyR2相对GAPDH表达量。组间比较采用Student's t检验或线性混合效应模型（Linear Mixed Effects Model），p≤0.05为差异显著。

研究结果

2.1 RyR2 Channels Form Nanoscale Clusters in CA1 Hippocampal Neurons（海马CA1神经元胞体RyR2形成纳米尺度簇）

研究人员通过dSTORM成像结合NeuN/MAP2界定CA1神经元胞体区，发现胞体RyR2呈离散纳米簇分布。簇面积呈近指数分布，平均面积为13420±499 nm2，对应约14.9±0.6个RyR2通道（按各向同性密堆积估算），约50%的簇含≤6个通道；相邻簇平均最近邻距离（NND）为118.8±3.8 nm。结论：成年小鼠海马CA1神经元胞体存在与心肌细胞类似的离散RyR2纳米簇。

2.2 CRU Formation by Neuronal RyR2 Clusters（神经元RyR2簇形成钙释放单元CRU）

以簇间距＜150 nm为标准划分CRU，分析显示约60%含≥2个通道的RyR2簇为孤立单簇型CRU，其余形成含多个簇的CRU，平均每CRU含2.4±0.1个RyR2簇。结论：神经元胞体RyR2簇可在足够近距离内形成功能性钙释放单元（CRUs），组成特征近似于心脏CRU。

2.3 RyR2 Expression Is Reduced in the AD Mouse Hippocampus（AD小鼠海马RyR2总表达降低）

Western Blot检测全海马组织，AD小鼠海马RyR2相对GAPDH的灰度值较WT降低约30%（WT: 0.89±0.09 A.U. vs AD: 0.62±0.03 A.U., p=0.02）。结论：9月龄APP/PS1小鼠海马总体RyR2蛋白表达显著下调。

2.4 Remodeling of Somatic RyR2 Clusters in AD Mouse CA1 Neurons（AD小鼠CA1神经元胞体RyR2簇发生重构）

对9月龄伴明显Aβ斑块沉积及认知缺陷的AD与WT小鼠进行dSTORM分析，AD组CA1神经元胞体RyR2平均簇面积显著缩小（AD: 10600±419 nm2，约11.8±0.5个通道；WT: 13420 nm2，约14.9个通道；p=0.01），提示AD中胞体RyR2簇丢失通道亚基；而簇间最近邻距离NND在AD组无显著变化（AD: 135.8±7.4 nm, p=0.32）。结论：AD小鼠CA1神经元出现RyR2簇缩小（簇内通道数减少）的纳米尺度重构，但簇间空间排布未变。

2.5 Neuronal RyR2 Clusters and Channels Are Lost From CRUs in the AD Mouse（AD小鼠神经元CRU中RyR2簇及通道数减少）

分析CRU组成发现，AD与WT组每CRU所含RyR2簇个数无差异（AD: 2.1±0.1簇/CRU, p=0.34），但因单个RyR2簇变小，导致每CRU内含RyR2通道总数显著降低（WT: 36.0±2.5 RyR2/CRU；AD: 24.7±1.8 RyR2/CRU，降低约31%, p=0.05）。结论：AD中CRU内RyR2通道总量丢失，与整体RyR2表达下降及单簇缩小相符。

讨论与结论总结

讨论指出，本研究首次在中枢神经元鉴定出与心肌类似的RyR2纳米簇及CRUs，为神经元RyR2活性及内在兴奋性调控提供了新结构基础。AD模型中出现RyR2簇缩小及CRU通道丢失的纳米重构，类比心衰中心脏RyR2簇重构致通道稳定性下降、开放概率增加及病理性Ca²⁺释放的机制，提示纳米尺度RyR2簇/CRU重构是跨组织（心、脑）共有的RyR2功能失调相关病理特征，并可能是AD中体细胞RyR2异常Ca²⁺释放及神经元功能障碍的新机制。全海马RyR2表达下降与CA1区单簇缩小、CRU通道流失相互印证。作者提出靶向RyR2纳米组织结构的干预策略或可成为抑制AD病理性Ca²⁺释放的新方向。

结论（Conclusion）：RyR2簇集及CRU形成是该通道的共有属性，代表调控RyR2活性从而影响细胞兴奋性的基础机制。本研究结果表明，以RyR2空间组织结构为靶点的干预手段，有望通过防止AD中病理性Ca²⁺释放及神经元功能障碍发挥治疗作用。