基于聚合物纳米气泡的超分辨超声细胞追踪

《Advanced Materials》：Super-Resolution Ultrasound Based Cell Tracking With Polymeric Nanobubbles

　　

追踪移植细胞在体内的命运仍然是细胞治疗开发与监测领域的主要挑战。本研究中，研究人员报道了一种基于纳米气泡（NB）的声学标记策略，该策略使超声定位显微技术（ULM）能够以单细胞尺度灵敏度及超分辨空间精度追踪肿瘤内移植细胞。研究人员开发了稳定、生物相容的聚（氰基丙烯酸丁酯）（PBCA）纳米气泡，其可被细胞高效内化并产生强胞内超声信号。此外，ULM实现了对单个细胞的实时可视化、定位及轨迹重建，研究对象涵盖流动仿体及小鼠乳腺癌模型。在后者中，研究人员通过动脉内注射对纳米气泡标记的骨髓来源单个核细胞（BMMC）进行了体内追踪，而未标记细胞则无法被检测。通过将细胞轨迹与基于微气泡（MB）的超分辨血管图谱整合，该研究策略可识别输送细胞的血管。这一具有临床兼容性的成像策略将ULM的应用拓展至血管映射之外，为基于细胞治疗的高分辨率动态监测提供了平台。

细胞治疗在多种疾病领域展现出巨大潜力，尤其在组织再生与免疫调节方面。然而，将其转化为临床实践仍面临挑战，其中关键瓶颈在于难以追踪给药细胞的体内分布及其是否到达预期靶点。现有医学影像技术各有局限：磁共振成像（MRI）软组织对比度佳但细胞检测灵敏度有限；正电子发射断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）虽灵敏度较高，但依赖放射性示踪剂，难以实现重复监测；生物发光成像（BLI）需基因改造且组织穿透性差，不适用于人体。超声（US）成像具有成本效益高、可实时成像、无电离辐射等优势，且易于整合至临床工作流程，但细胞与周围组织声阻抗相似导致检测困难。虽有研究通过工程化气体填充气泡、相变纳米液滴蒸发或遗传声学报告系统增强对比度，但各有不足：纳米液滴依赖破坏性蒸发电脉冲，无法进行纵向监测；遗传声学报告系统面临制造可行性、哺乳细胞表达效率及监管障碍等问题。气体填充气泡受到越来越多的关注，但现有气泡壳稳定性差、超声暴露下易聚并，尚无适用于细胞标记的成熟配方。超声定位显微技术（ULM）作为超分辨技术，通过定位并追踪单个微气泡实现微血管结构映射，空间分辨率超越衍射极限，为体内标记单细胞的检测与追踪带来新可能，但其在细胞追踪中的应用尚未被证实。

在此研究背景下，研究人员制备了稳定的聚合物纳米气泡作为细胞标记剂，并探索其与ULM联合用于细胞追踪的潜力，同时研究ULM血管图谱与细胞轨迹结合能否实现细胞输送血管的识别。研究人员假设该技术组合可实现单细胞水平检测，为体内治疗细胞监测提供 exceptional 灵敏度与空间精度，并推动实时、定量、临床可行的细胞追踪技术发展。

该研究采用的主要关键技术方法包括：基于双乳化-冻干法制备PBCA纳米气泡的纳米气泡合成与表征技术；涉及J774A.1巨噬细胞系及原代BMMC的细胞标记与功能评估技术；利用凝胶仿体及流动仿体的体外超声成像技术；在两种小鼠乳腺癌模型（EO771原位移植模型及4T1皮下移植模型）中开展的体内细胞追踪技术，样本队列来源为C57BL/6及BALB/c品系小鼠；以及ULM后处理技术，包括运动校正、奇异值分解（SVD）滤波、高斯匹配滤波定位、马尔可夫链蒙特卡罗数据关联（MCMCDA）算法追踪等。

研究结果部分：

**2.1 PBCA纳米气泡的制备与表征**

为构建回声增强细胞，研究人员利用纳米尺度的气体填充气泡作为胞内声学标记。PBCA纳米气泡采用双乳化法制备聚合物核壳纳米颗粒，经冻干形成中空气体填充结构。与微气泡相比，纳米气泡悬浮液静置24小时后仍保持均一乳白分散状态，表明其浮力低、分散性佳。库尔特计数分析证实纳米气泡样品中无微尺度群体；纳米颗粒追踪分析（NTA）显示其平均直径为217±40 nm，粒径分布窄（PDI=0.08±0.03）。透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）显示其呈球形气泡样结构；冷冻SEM揭示了断裂纳米气泡内部的明显空腔，为空心结构提供了直接证据。动态光散射（DLS）评估显示，PBCA纳米气泡在PBS及含10%胎牛血清（FBS）的PBS中于37°C下维持稳定水动力学直径及低多分散指数长达24小时，且在酸性条件（pH 4.5）下仍保持稳定，支持其适用于胞内标记。

**2.2 PBCA纳米气泡的高效细胞标记**

为评估PBCA纳米气泡的本征回声性，研究人员将其包埋于2%凝胶仿体中进行超声成像。结果显示纳米气泡在B模式和非线性对比模式下均可产生可检测信号，验证了其静态条件下的声学可见性。在18 MHz超声激发下，纳米气泡主动产生非线性声学回声。与等效气体体积的微气泡相比，纳米气泡在对比模式下产生的声学强度约为其5%。

利用J774A.1巨噬细胞的高吞噬活性，研究人员评估了体外胞内纳米气泡标记的可行性。当纳米气泡与细胞比例为10⁴:1、5×10⁴:1及10⁵:1时，细胞活力分别为86.5±5.5%、82.7±0.2%和82.3±0.6%，比例增至2.5×10⁵:1则活力显著降至64.0±0.4%。基于此，10⁵:1被选为最佳标记条件。纳米气泡标记细胞在B模式和对比模式超声下24小时后仍可检测，且检测细胞数及平均灰度值均无统计学显著差异。临床超声系统（Canon Aplio i800, 4 MHz）的评估显示，纳米气泡标记细胞在对比模式下可产生稳健、清晰可辨的信号。

共聚焦激光扫描显微镜及三维重建显示，纳米气泡分布于细胞质体积内，荧光信号定位于细胞膜与细胞核之间，证实为内化而非表面结合。定量分析估计每个细胞含431±40个纳米气泡。

三维系列超声扫描显示，纳米气泡标记细胞可在三维空间中被解析，浓度依赖性增加可检测回声数，而未标记样本背景信号极低。在静态条件下，单个与纳米气泡标记细胞相关的回声事件可被ULM流程成功定位。流动条件下，未标记细胞在B模式中信号微弱且对比模式无信号，而纳米气泡标记细胞在两种模式下均产生明显信号。ULM分析成功将定位的细胞相关回声追踪并重建为轨迹，速度信息经颜色编码，揭示了符合血管流体动力学预期的层流 profile。

**2.3 纳米气泡标记骨髓来源单个核细胞的超声成像**

研究人员以原代BMMC替代J774A.1巨噬细胞系用于后续体内评价。BMMC通过红细胞裂解及基于尺寸的富集与离心分离。荧光测量显示纳米气泡摄取呈时间依赖性，2小时孵育后信号 maximal；流式细胞术证实大量罗丹明阳性活BMMC存在。凝胶仿体中，纳米气泡标记的BMMC在B模式和对比模式下均产生可检测信号。

荧光排泄实验表明，细胞内化纳米气泡经胞吐作用主动处理和排泄。流式细胞术分析显示，纳米气泡标记保留了B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞及自然杀伤细胞等主要免疫亚群的生理分布。T细胞激活实验（抗CD3/抗CD28抗体刺激）证实，纳米气泡标记不干扰T细胞激活功能，CD69上调的双阳性细胞群（Rho⁺/CD69⁺）的存在证明了这一点。

**2.4 基于超分辨超声的体内细胞追踪**

最初在EO771原位乳腺癌模型中，纳米气泡标记BMMC经静脉给药，虽在下腔静脉检测到灌注信号，但肿瘤内对比增强极微，推测与肺毛细血管床暂时滞留有关。免疫荧光分析证实注射细胞成功外渗并浸润肿瘤微环境。

基于上述发现，后续实验采用4T1皮下乳腺癌模型并进行动脉内给药。超声成像期间，未标记BMMC注射未在肿瘤区域产生可检测对比信号；纳米气泡标记BMMC则导致肿瘤内对比模式超声信号明显增加。高通量破坏性超声脉冲清除残余纳米气泡信号后，注入PBCA微气泡进行ULM分析以绘制肿瘤血管。ULM处理显示，纳米气泡标记组产生了高质量的细胞轨迹图，而未标记组仅见稀疏短轨迹。

最大强度投影（MIP）图像描绘了灌注肿瘤血管。将MIP参考层、微气泡轨迹（红色）和细胞轨迹（蓝色）叠加，可直接比较血管架构与细胞迁移：纳米气泡标记组的重建细胞轨迹主要与微气泡定义的血管共定位，呈沿血管路径聚集的轨迹簇，表明标记细胞主要在强灌注血管内移动。纳米气泡标记细胞速度略低于微气泡（平均速度1.2±0.6 vs. 1.5±0.7 mm/s），与层流行为中大型颗粒速度降低一致。最大速度分布跨越不同的低、高速范围，可能反映肿瘤血管内异质性流动 profile。

流式细胞术分析确认，未标记组（0.88±0.2%）和纳米气泡标记组（0.96±0.4%）的肿瘤中均存在注射细胞，结合ULM成像追踪结果，证实了移植细胞的成功输送及纳米气泡赋能ULM用于体内细胞追踪的可行性。

讨论与结论部分总结：

研究人员在本研究中建立了基于纳米气泡的声学标记策略，使ULM能够以单细胞尺度追踪体内移植细胞。该策略通过稳定的PBCA纳米气泡实现胞内标记，结合先进ULM后处理，在肿瘤内以超分辨空间精度实现细胞迁移可视化。

PBCA纳米气泡的选择是该系统性能的关键决定因素。近年研究质疑纳米气泡的本征回声性，认为信号可能源于微尺度气泡污染或超声暴露下的气泡聚并。但研究人员结果表明，这些担忧并非普遍适用于聚合物体系：PBCA壳生成的纳米气泡在生理及酸性条件下具有高胶体稳定性、抗聚并性及足够回声性；库尔特计数分析证实无微尺度气泡污染，NTA和冷冻SEM提供了空心气核架构的直接证据。

与既往微气泡工程化回声巨噬细胞的研究相比，纳米气泡浮力低、可与细胞在标准培养条件下高效相互作用，且内化不损害活力，更适合细胞标记应用。PBCA纳米气泡可制成冻干粉剂型，利于储存、运输和规模化生产。尽管单个自由漂浮纳米气泡的声学散射弱于等效气体体积的微气泡，但胞内密集集群（平均431±40个/细胞）产生显著的局部声阻抗失配，使细胞可作为宏观声学散射体。

通过内吞作用实现胞内标记是该方法的另一关键设计特征：纳米气泡摄取通过简单孵育实现，无需化学修饰、靶向配体或遗传操作；内化后可通过降解或胞吐生理处理，最小化对细胞功能的长期扰动。这与需要膜修饰的细胞表面标记策略及面临转染效率、监管复杂性和可制造性挑战的遗传声学报告系统形成对比。

体内实验强调了给药途径对有效细胞追踪的重要性：静脉注射常导致肺滞留，限制远端靶点输送；动脉内给药增加了到达肿瘤的细胞数量并实现了超声检测。这一发现凸显了有效体内细胞追踪依赖于有效标记策略与优化输送途径的结合。

该工作的主要进展在于将胞内纳米气泡标记与ULM整合，首次展示了ULM在体内追踪移植细胞中的应用。ULM不仅检测细胞存在，还实现了个体细胞轨迹重建及速度信息提取，分辨率达微米尺度。通过将细胞轨迹与微气泡衍生血管图谱结合，能够区分被循环细胞灌注的血管与未被灌注的血管。

研究人员指出，ULM在传统上作为微血管成像工具开发，但其更广泛的临床采用受工作流程复杂性及对组织学作为参考标准依赖的限制。本工作将ULM从血管映射扩展至动态细胞追踪，显著拓展了其应用空间。整合纳米气泡细胞标记与ULM为评估细胞治疗提供了非电离、空间精确的方法，解决了超越静态生物分布、实时功能映射细胞-血管相互作用的未满足临床需求。

同时存在若干技术挑战：研究中使用的高频临床前系统虽提供高空间分辨率，但背景噪声高、穿透深度有限；非线性对比模式的帧率限制（约23 fps）可能影响轨迹密度，但MCMCDA运动模型追踪方法可桥接帧间空间间隙。当前平台成功追踪了纳米气泡标记细胞的血管内运动，但一旦细胞外渗至肿瘤微环境则难以纵向追踪，因静止细胞难以从静态组织背景中声学分离。此外，内化纳米气泡可能随时间经生理排泄或降解，限制长期追踪适用性。遗传编码的气囊报告系统可提供持续追踪的替代策略，但其临床转化因需基因改造而面临挑战。

研究结论指出，稳定的PBCA纳米气泡实现了可靠的胞内声学标记，与ULM结合可实现体内移植细胞的超分辨追踪。该平台解决了当前细胞追踪方法的关键局限，为未来监测、优化和个性化细胞治疗的研究奠定了基础。