UCHL3调控亚基因组黄病毒RNA凝聚体以促进病毒增殖

《Advanced Science》：UCHL3 Regulates Subgenomic Flaviviral RNA Condensates to Promote Virus Propagation

　　

黄病毒亚基因组RNA（subgenomic flaviviral RNA, sfRNA)能够拮抗抗病毒防御，但sfRNA在细胞内的组织方式及其维持机制尚不清楚。研究人员鉴定出泛素C端水解酶L3（ubiquitin C-terminal hydrolase L3, UCHL3)作为黄病毒sfRNA稳定性和功能的后翻译修饰调节因子。利用基于活性的蛋白质谱分析（activity-based protein profiling, ABPP)，研究人员在寨卡病毒（Zika virus, ZIKV)和登革病毒（dengue virus, DENV)感染过程中发现UCHL3被激活。CRISPR-Cas9敲除UCHL3显著损害了多种细胞模型中的病毒复制并降低病毒蛋白表达；野生型UCHL3重组可挽救这些缺陷，而催化失活突变体（C95A)无法恢复复制，证实了去泛素化酶活性的必要性。通过邻近生物素化sfRNA相互作用组捕获实验，研究人员证明UCHL3与sfRNA复合物存在物理相互作用。重要的是，UCHL3缺失加速RNase L激活，导致sfRNA从保护性P-小体重定位至PABPC1阳性的RNase L诱导体（RNase L-induced bodies, RLBs)，引发病毒RNA降解。RNase L敲低可恢复UCHL3缺陷细胞中的病毒复制，证实了RNase L依赖性抗病毒效应。UCHL3的促病毒作用通过干扰素非依赖机制发挥作用，因为即使外源性干扰素处理后复制缺陷仍然存在。因此，该研究将UCHL3鉴定为sfRNA在促病毒与抗病毒RNA凝聚体之间命运的调节因子，揭示了调控病毒RNA稳定性的后翻译修饰机制及黄病毒感染的潜在治疗靶点。

黄病毒包括寨卡病毒、登革病毒和西尼罗病毒等，对全球公共卫生构成严重威胁，可引发严重神经系统并发症、出血热和出生缺陷。这些正链RNA病毒已进化出精密的策略以劫持细胞机制实现高效复制，同时逃避先天免疫应答。亚基因组黄病毒RNA（sfRNA)是黄病毒传播力和流行潜力的标志性特征，由宿主5'-3'外切核糖核酸酶XRN1在病毒基因组降解过程中于RNA二级结构处停滞而产生。sfRNA能够拮抗抗病毒免疫、促进复制、增强病毒适应性和宿主适应性，但其组织维持机制尚不清楚。近年证据表明，sfRNA可组织成类似应激颗粒的动态核糖核蛋白复合物，形成生物分子凝聚体以浓缩病毒和细胞因子，这对复制和免疫逃逸至关重要。然而，调控这些凝聚体组装、维持和调节的分子机制，特别是后翻译修饰层面的调控，仍是 largely unexplored 的领域。鉴于泛素化在控制蛋白质命运中的核心作用以及病毒劫持去泛素化酶的已有报道，研究人员假设细胞去泛素化酶（deubiquitylating enzymes, DUBs)可能调控sfRNA凝聚体动力学以促进黄病毒复制。

研究人员首先采用基于活性的蛋白质谱分析（activity-based protein profiling, ABPP)，使用泛素-乙烯基甲酯（Ub-VME)探针标记催化活性的DUBs，在ZIKV和DENV感染期间鉴定出UCHL3等多种DUB被激活。随后，研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了UCHL3敲除（KO)的A549和HEK293T细胞系，并感染非洲谱系MR766、亚洲谱系新喀里多尼亚ZIKV及DENV2（16681)。结果显示，UCHL3缺失显著降低两种黄病毒的病毒滴度和病毒RNA积累，且病毒非结构蛋白（NS5、NS3)和结构蛋白（E、C)均出现广泛减少，提示UCHL3影响病毒RNA翻译或复制而非靶向特定病毒蛋白。研究人员进一步通过慢病毒转导在UCHL3^-/-细胞中重组表达野生型HA-UCHL3或催化失活C95A突变体，结果发现仅野生型UCHL3能挽救病毒滴度，证实酶活性对其促病毒功能不可或缺。

为探究UCHL3在黄病毒感染中的亚细胞定位变化，研究人员进行了免疫荧光分析和生化分级分离实验。结果显示，mock感染细胞中UCHL3主要定位于细胞质，而ZIKV感染后UCHL3发生显著的重分布，呈现细胞核与细胞质双区室定位，且该现象在产物性感染细胞和旁观者细胞中均存在，提示由可溶性炎症介质或细胞应激反应触发。邻近连接实验（proximity ligation assay, PLA)显示，感染后UCHL3与P-小体标志物DCP1b的相互作用显著增强，而与RLB标志物PABPC1的相互作用仅适度增加。同时，UCHL3缺失导致病毒诱导的内质网重塑结构显著破坏，病毒蛋白和dsRNA积累减少，表明UCHL3对建立或维持生产性病毒复制/装配环境具有重要贡献。

为确定UCHL3是否与病毒RNA直接相互作用，研究人员首先排除了UCHL3与病毒蛋白的稳定相互作用，随后采用邻近生物素化sfRNA相互作用组捕获策略（sfRAPID)系统鉴定sfRNA邻近蛋白质组。该策略利用BoxB茎环结构招募BirA-λN融合蛋白（BASU)，在生物素补充下对sfRNA邻近蛋白进行生物素化标记，经链霉亲和素亲和纯化后进行质谱分析。银染分析和免疫印迹证实，UCHL3被特异性招募至sfRNA核糖核蛋白复合物，且与已知sfRNA相互作用蛋白G3BP1、UBAP2L等共纯化。LC-MS/MS无偏见分析进一步确认了G3BP1、DDX3、DDX6、UBAP2L等P-小体/应激颗粒组分的富集。功能上，UCHL3过表达显著增加ZIKV和DENV的基因组RNA及sfRNA积累，且呈剂量依赖性关系，表明UCHL3不仅物理结合而且功能促进病毒RNA物种的积累。

为阐明UCHL3缺失损害黄病毒复制的分子机制，研究人员聚焦2'-5'寡腺苷酸合成酶/RNase L（OAS/RNase L)通路。通过荧光共振能量转移（FRET)法检测2-5A水平、Bioanalyzer分析rRNA完整性及计算RNase L激活指数，研究人员发现UCHL3^-/-细胞中2-5A积累显著升高，rRNA降解加剧，且RNase L激活时间提前（约12小时 vs 野生型约18小时)、幅度增大。野生型UCHL3重组可恢复2-5A水平和rRNA完整性，而C95A突变体不能抑制RNase L过度激活。RNA-FISH联合免疫荧光显示，野生型细胞中sfRNA与DCP1b阳性P-小体共定位，而UCHL3缺失后sfRNA从P-小体重分布至PABPC1阳性RLBs；RNase L敲低可阻止该重分布，恢复sfRNA与P-小体的关联，并挽救病毒滴度，证实sfRNA重定位的RNase L依赖性及RLBs的身份。

研究人员进一步探究UCHL3促病毒功能是否通过干扰素信号介导。检测ISG15、IRF7等干扰素刺激基因表达发现，UCHL3^-/-细胞对exogenous干扰素刺激的反应性降低，但即使在exogenous干扰素处理条件下，UCHL3缺失仍维持病毒复制缺陷，表明其促病毒功能独立于干扰素通路调控。ISRE-荧光素酶报告基因实验和IFN-β启动子实验进一步证明，UCHL3是sfRNA发挥免疫抑制功能所必需的，缺失UCHL3时sfRNA无法抑制干扰素诱导和信号传导。

研究结论指出，UCHL3作为黄病毒利用的关键宿主去泛素化酶，通过控制RNA-蛋白凝聚体动力学维持病毒基因组稳定性。UCHL3调控sfRNA在保护性P-小体与降解性RLBs之间的分配动力学，延迟从保护性向降解性区室的转变，这是一种此前未被认识的后翻译控制RNA颗粒命运决定的调控层。该促病毒功能在非洲和亚洲谱系ZIKV及DENV2中保守，但不同病毒对UCHL3的依赖程度存在差异。UCHL3可能通过去泛素化P-小体特异性组分或 restraining RNase L激活本身来发挥作用，具体机制有待通过鉴定UCHL3底物来阐明。此外，UCHL3或相关去泛素化酶可能成为广谱RNA病毒控制的潜在靶点。