FRET与超分辨率显微成像联合揭示纳米尺度下的激酶活化与线粒体活性

《Advanced Science》：Combining Fret and Super-Resolution Microscopy Reveals Kinase Activation and Mitochondrial Activity at the Nanoscale

　　

蛋白激酶是细胞内特定亚细胞区室以及微区或纳米区信号转导的关键调控因子。基于F?rster共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器是追踪激酶动力学的有力工具。然而，这类方法通常受限于空间分辨率。Aurora kinase A（AURKA）作为一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，近来已被证实是线粒体生理的重要调节因子。然而，以亚衍射精度可视化AURKA的激活与活性仍然具有挑战性。研究人员在此提出BioSenSRRF，这是一种将常规FRET生物传感器与超分辨率径向涨落（SRRF）显微术相结合的通用策略。BioSenSRRF无需对现有探针进行改造，可基于标准显微成像平台实施，并得到公开可用图像分析工具的支持。借助BioSenSRRF，研究人员发现线粒体AURKA的激活与活性被区室化于含有ATP合酶的不同线粒体结构域中。这些亚结构域依赖于AURKA催化活性，并且可通过经验证的AURKA抑制剂加以改变。最后，研究人员证实，与癌症相关的F31I多态性可增强ATP合酶富集亚结构域中的AURKA激活及ATP生成。总体而言，BioSenSRRF提供了一个可广泛获取的技术框架，用于提升基因编码生物传感器的空间分辨率。该策略为解析激酶的亚细胞组织方式及其对生理和疾病过程的贡献开辟了新路径。

该论文发表于《Advanced Science》，核心目标是解决一个长期存在的技术与生物学交叉难题：如何在活细胞中以亚衍射、近纳米尺度的空间精度，同时解析激酶活化状态及其功能输出。蛋白激酶在细胞内信号转导中具有高度区室化特征，其活化、底物识别和功能执行常常发生于特定细胞器、微区甚至纳米结构域内。传统生化方法能够证明激酶可发生自磷酸化并作用于多种底物，但难以回答激酶为何在特定时间、特定亚细胞位置只作用于有限底物的问题。基因编码荧光生物传感器，尤其是基于F?rster共振能量转移（FRET）的探针，为追踪激酶活化与活性提供了时空分辨能力；但其空间分辨率仍受衍射极限约束，使研究人员难以精确定义激酶信号究竟发生在线粒体网络中的哪些微区或纳米区。该问题对于AURKA尤为关键，因为既往研究已提示AURKA除经典有丝分裂功能外，还在线粒体中参与ATP生成调控，但其在线粒体内究竟如何被激活、活性如何局部化、是否存在特定代谢热点，仍缺乏直接成像证据。因此，开展这项研究既是为了突破现有FRET成像的空间分辨率瓶颈，也是为了回答AURKA在线粒体内的空间组织规律及其病理变异体功能后果。

研究人员建立了BioSenSRRF方法，将常规FRET生物传感器与增强型超分辨率径向涨落重建（eSRRF）整合，用于提升现有探针的空间定位精度，而无需重新设计探针骨架或更换荧光对。研究选择了两类互补传感器：其一是AURKA构象型生物传感器，用于检测AURKA在Thr288位点自磷酸化后引发的激活构象变化；其二是线粒体ATP探针MitoGO-ATeam2，用于报告线粒体内ATP生成变化，从而间接反映AURKA在线粒体中的功能输出。通过这一策略，研究人员证明AURKA的激活与其促进ATP生成的效应并非均匀分布，而是局限于不同的线粒体亚结构域，并且这些亚区与ATP合酶富集区域密切相关。进一步地，研究表明不同AURKA抑制剂对这些亚结构域仅表现出部分、簇特异性的影响，而癌症相关F31I多态性则会增强ATP合酶富集位点上的AURKA激活及ATP生成。该研究的重要意义在于，一方面提出了一种适用于现有FRET探针的、可普及的超分辨率分析框架；另一方面从机制上揭示了AURKA在线粒体中的激活和代谢调控具有显著的纳米尺度区室化特征，为理解激酶在细胞器内的功能异质性以及肿瘤相关代谢重编程提供了新的证据。

在技术方法上，研究主要采用了以下几类关键策略。首先，在MCF7细胞中表达AURKA构象型FRET传感器及线粒体ATP传感器MitoGO-ATeam2，并结合供体单独表达对照进行比值型FRET分析。其次，使用旋转盘共聚焦采集多帧图像，经Fiji/ImageJ中的eSRRF算法进行超分辨重建，再在重建后的线粒体区域内计算FRET指数。第三，利用像素级相关性分析、直方图分布分析和随机线分析（random line analysis），对线粒体内FRET热点（Hotspots）与冷点（Coldspots）进行空间分类，并结合k-means聚类与轮廓系数评估不同FRET变化幅度簇。第四，结合药理学处理、线粒体分馏免疫印迹（Western blot）以及线粒体靶向序列（MTS）的分子建模，分析AURKA抑制剂和F31I多态性对线粒体导入、激活及功能输出的影响。样本来源主要为人乳腺癌细胞系MCF7及人胚肾细胞系HEK293。

2.1 Cumulative FRET and eSRRF Microscopy Improves the Spatial Resolution of a Genetically Encoded Biosensor of Kinase Activation
本节首先验证BioSenSRRF是否适用于AURKA激活传感器。研究人员在MCF7细胞中表达AURKA FRET生物传感器及仅含供体的阴性对照，并用MitoTracker DeepRed标记线粒体。通过连续采集eGFP、mCherry和线粒体通道图像并进行eSRRF重建，研究人员发现AURKA传感器在线粒体区域的平均FRET指数显著高于供体对照，说明该方法可以在超分辨条件下保留并检测激活相关的FRET变化。进一步比较重建前后图像可见，尽管绝对FRET值有所变化，但传感器与对照之间的净差异保持一致，说明eSRRF并未扭曲FRET判读。像素级相关性分析显示FRET信号与GFP强度相关性较低，提示FRET指数不依赖于探针表达丰度。随后，研究人员应用AURKA催化抑制剂MLN8237，观察到AURKA传感器FRET指数显著下降，验证了该管线能够检测线粒体中AURKA的激活及其抑制。

2.2 The BioSenSRRF Pipeline Is Compatible With a Genetically-Encoded Biosensor for Mitochondrial ATP Production
本节进一步证明BioSenSRRF不仅适用于激酶构象传感器，也适用于功能性代谢传感器。研究人员在线粒体中表达MitoGO-ATeam2及其供体对照MitoGFP-ATeam2，结果显示ATP传感器具有显著FRET读出，而对照几乎无FRET。重建前后比较表明，eSRRF不会改变传感器识别ATP变化的总体能力。相关性分析提示该探针的FRET信号亦不受表达量、光漂白或在线粒体内扩散的明显影响。研究人员进一步以氰化钾（KCN）抑制线粒体复合体Ⅳ，观察到MitoGO-ATeam2的FRET指数显著下降，证明该探针对ATP生成降低具有敏感响应。通过比较MIC60与TOMM20标记峰间距，研究人员还量化了eSRRF带来的分辨率提升，支持该方法用于线粒体亚结构分析的技术可行性。

2.3 The Random Line Analysis Reveals Spatially-Resolved FRET Hotspots of ATP Production
在确认技术可行后，研究人员开始解析AURKA促进ATP生成的空间模式。既往结果显示AURKA激酶活性对其线粒体定位至关重要，因此研究比较了AURKA过表达、激酶失活突变体AURKA^K162M以及对照条件下的MitoGO-ATeam2信号。结果显示，AURKA过表达显著升高线粒体ATP相关FRET指数，而AURKA^K162M不能产生相同效应，说明AURKA催化活性是增强线粒体ATP生成的必要条件。进一步的像素级直方图分析发现，AURKA过表达仅引起FRET分布模式的轻度整体右移，提示ATP增加并非均匀发生于整个线粒体网络。为识别局部代谢热点，研究人员建立随机线分析，沿线粒体区域随机绘制线段并提取像素级FRET变化曲线，依据二阶导数将其区分为FRET热点和冷点，再通过k-means将不同变化幅度分为高、中、低三类delta簇。结果表明，AURKA过表达显著增加FRET热点比例，尤其集中于高delta簇，说明AURKA促进的ATP生成主要发生于空间受限的离散位点，而非整个线粒体网络的一致性增强。

2.4 Xanthohumol Lowers AURKA Activation and the Abundance of AURKA-Dependent ATP Hotspots
本节分析Xanthohumol对AURKA激活及其代谢输出的影响。研究人员首先在表达AURKA传感器的细胞中应用Xanthohumol，发现线粒体区域AURKA的FRET指数显著降低，说明该化合物可削弱线粒体AURKA激活。随后在MitoGO-ATeam2体系中分析ATP生成，结果显示Xanthohumol对未过表达AURKA的对照细胞几乎无影响，但能显著降低AURKA过表达细胞的ATP相关FRET指数，与其纠正AURKA诱导代谢重编程的既往结果一致。进一步通过随机线分析发现，Xanthohumol显著减少AURKA依赖的FRET热点总量，但其作用主要集中于中等和低delta簇，而对高delta簇中的热点影响有限。这表明Xanthohumol能够部分逆转AURKA驱动的线粒体ATP热点分布，但不能完全消除最强的代谢活跃位点。

2.5 ATP Hotspots Are Lowered With a Mitochondrial-Specific AURKA Inhibitor
研究人员接着考察线粒体特异性AURKA抑制剂HMBB的作用。HMBB处理可使AURKA构象传感器的线粒体FRET指数下降，表明其确实抑制线粒体内AURKA的激活。在MitoGO-ATeam2实验中，HMBB对基础ATP生成无显著影响，但可降低AURKA过表达所带来的ATP相关FRET升高。像素级分布分析显示，HMBB可逆转AURKA导致的FRET分布改变。随机线分析进一步指出，HMBB同样减少了AURKA诱导的FRET热点，且主要作用于中、低delta簇，而高delta簇热点仍然保留。由此可见，无论是非线粒体特异性的Xanthohumol还是线粒体相关的HMBB，其对AURKA依赖ATP热点的抑制都具有簇选择性，均难以完全抑制高活性热点。

2.6 The Cancer-Related AURKA Polymorphism F31I Alters AURKA Activation and the Spatial Distribution of Mitochondrial Activity Subdomains
本节聚焦癌症相关AURKA多态性F31I的功能后果。研究人员发现，AURKA和AURKA^F31I过表达均导致线粒体网络缩减和线粒体质量下降，且两者程度相似。将MitoGO-ATeam2 FRET指数按线粒体面积归一化后，AURKA与AURKA^F31I均表现出与对照相比升高的ATP水平，提示两者均可提高总体线粒体ATP。然而，随机线分析揭示AURKA^F31I显著改变了亚线粒体FRET亚域的空间分布：与普通AURKA增加热点不同，AURKA^F31I反而降低了热点比例，并在多个簇中伴随冷点增加。这说明尽管总体ATP升高，AURKA^F31I会重塑线粒体内ATP空间分布，形成更多ATP较低的局部亚域。随后，研究人员使用AURKA与AURKA^F31I构象传感器直接检测其在线粒体中的激活，结果显示两者平均激活水平差异不显著，直方图和随机线分析总体也较相似，仅AURKA^F31I表现出更大的空间变异性。这提示F31I对AURKA线粒体功能的影响，主要体现在亚区室分布重塑，而非整体平均激活水平显著增强。

2.7 BioSenSRRF Reveals AURKA Activation and Activity on the ATP Synthase
为解释F31I变异为何改变ATP亚域分布，研究人员进一步检验其是否增强AURKA导入线粒体。在线粒体分馏及免疫印迹分析中，AURKA^F31I较普通AURKA显示更高丰度的线粒体加工异构体，说明该变异促进AURKA进入线粒体。分子建模显示，F31I位于AURKA线粒体靶向序列（MTS）中，可能增加该区域α螺旋末端柔性，从而有利于线粒体导入。随后，研究人员以ATP5A作为ATP合酶（Complex V）富集区域的标志，比较整个线粒体区域与ATP5A阳性区域中的AURKA激活。结果表明，虽然AURKA与AURKA^F31I在线粒体整体范围内的平均FRET指数相近，但在ATP5A阳性区域，AURKA激活显著增强，而AURKA^F31I的增强更为明显。这一结果直接表明AURKA优先在线粒体ATP合酶富集簇上激活，且F31I变异进一步加强这一倾向，从而解释其对ATP生成空间分布的重塑效应。

讨论部分强调，BioSenSRRF的价值在于以标准显微镜配置和现有FRET探针为基础，实现更高空间分辨率的活细胞功能成像。研究人员指出，这一方法既避免了为适配超分辨成像而重新工程化探针的繁重工作，也通过公开的Fiji/ImageJ与RStudio分析流程、独立软件以及自动化数据处理，降低了使用门槛。文中同时指出，当前方法的时间分辨率仍受多通道、多帧采集限制，背景信号扣除亦需针对不同探针和成像条件优化。对于生物学意义，研究表明AURKA在线粒体内的激活和功能输出并非弥散式分布，而是集中在具有代谢意义的亚结构域中，且这些结构域可被药物部分调控，并与ATP合酶复合体密切相关。该策略尤其适合在缺乏明确底物传感器时，将激酶激活与器官elle功能输出联系起来，从而揭示激酶在细胞器内部的区室化机制。

研究结论部分可概括为：BioSenSRRF能够提升基因编码FRET生物传感器对激酶激活和功能活性的空间分辨率。利用该流程，研究人员在线粒体中鉴定出AURKA激活簇和ATP生成簇，证明这些簇依赖AURKA激酶活性，且AURKA抑制剂仅能部分影响其分布。进一步地，这些簇富集于线粒体复合体Ⅴ（Complex V）相关区域，AURKA在这些亚线粒体结构域上发生激活。上述结果表明，BioSenSRRF具有推广至多种基因编码探针的通用潜力，并可用于纳米尺度生化活动的追踪与解析。