不对称吡啶并菲啶-吡啶甲酸配体支撑的Mn(II) MRI对比剂

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Mn(II) MRI contrast agents supported by unsymmetric pyridinophane-picolinate ligands

　　

钆基对比剂（Gadolinium-based contrast agents）常用于磁共振成像（MRI）。然而，锰基试剂因其有利的弛豫性能和增强的生物相容性而日益受到关注，特别是考虑到与无环Gd³⁺螯合物给药相关的肾源性系统性纤维化（nephrogenic systemic fibrosis, NSF）问题。在本研究中，研究人员开发了一系列基于2,11-二氮杂[3.3](2,6)吡啶并菲啶大环（2,11-diaza[3.3](2,6)pyridinophane macrocycle）的螯合剂，以改善相应Mn(II)配合物的弛豫性（relaxivity）。研究人员评估了配位数和侧臂选择如何影响这些锰基MRI对比剂的效率。分光光度滴定（Spectrophotometric titrations）显示，七配位配合物比六配位配合物在热力学上更稳定，这符合Mn(II)的预期。然而，[Mn(TE-2)]⁺表现出比[Mn(TE-5)]和[Mn(TE-6)]⁺更大的动力学惰性（kinetic inertness），表明额外的螯合臂可能通过促进与其他金属离子如Cu(II)和Zn(II)的配位来降低惰性。发现胺甲基化（Amine methylation）可增强动力学惰性且不影响弛豫性，因为[Mn(TE-2)]⁺表现出与[Mn(BPPA)]相似的弛豫性。鉴于其有希望的体外性能，研究人员在9.4?T MRI扫描仪上对小鼠测试了[Mn(TE-2)]⁺。该锰化合物主要通过肾脏途径清除，低心脏对比增强表明极少的白蛋白结合，这与其他有前景的MRI对比剂的行为一致。

磁共振成像（MRI）是广泛使用的医学技术，约三分之一扫描需对比剂以增强血管和肿瘤可视化。钆基对比剂（Gadolinium-based contrast agents）常用，但无环Gd³⁺螯合物可能释放游离Gd³⁺，导致肾源性系统性纤维化（NSF），尤其肾功能不全患者。Mn²⁺因有利弛豫性（relaxivity）、长电子弛豫时间、高自旋态（S=5/2）和快速水交换成为替代候选。然而，设计合适螯合剂面临挑战：需同时提供热力学稳定性和动力学惰性（kinetic inertness）以对抗体内解离，尤在Cu²⁺或Zn²⁺等内源金属存在下，同时维持足够水合数（q）支持水弛豫而不增加不稳定性。已有无环螯合物如[Mn(PyC3A)]进入临床试验，大环螯合物如双吡啶烷（Bispidine）配体、吡啶并环（pyclen）基PC2A等表现潜力，但示例稀少。2,11-二氮杂[3.3](2,6)吡啶并菲啶（pyridinophane）框架未充分研究用于Mn²⁺ MRI对比剂。研究人员认为该框架可降低配体碱性、增加刚性，可能提高稳定性和惰性，并增加分子量改善弛豫性。因此，研究人员合成三种不对称吡啶并菲啶螯合剂（含吡啶甲酸、吡啶甲基或乙酸臂），系统评估配位数和侧臂对Mn(II)配合物性能的影响，得出[Mn(TE-2)]⁺具备优异动力学惰性、有利弛豫性和肾清除行为，是进一步体内评价的有力候选。该论文发表在《Journal of Inorganic Biochemistry》。

关键核心技术方法包括：有机螯合剂合成（选择性保护、SN2反应、脱保护及Eschweiler-Clarke甲基化等）；金属配合物合成（厌氧条件下Mn(ClO₄)₂与配体在Cs₂CO₃和MeOH中反应）；单晶X射线衍射（SC-XRD）确定固态结构；紫外-可见分光光度pH滴定（UV-Vis pH spectrophotometric titrations，0.1 M KCl，25°C）测定配体质子化常数和金属配合物稳定常数；基于高效液相色谱（HPLC）的Zn²⁺竞争跨金属化实验（25当量ZnCl₂，25°C或个别1:1条件）测定动力学惰性；循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV，Ag/AgCl参比电极）测定氧化电位；¹⁷O横向弛豫率测量（Swift-Connick方程拟合）获得水合数（q）和水交换速率（k_ex）；弛豫率测量（1.4 T NMR，33°C，50 mM HEPES pH 7.4，0.15 M NaCl，含0.67 mM BSA）；体内MRI研究（9.4 T Bruker 94/30 Biospec，3只小鼠，静脉注射80 μmol/kg [Mn(TE-2)]⁺）。

**2.1 有机螯合剂的合成**：通过选择性保护和修饰，合成了三种不对称配体TE-2（含吡啶甲酸臂和N-甲基）、TE-5（含吡啶甲酸臂和乙酸臂）、TE-6（含吡啶甲酸臂和吡啶甲基臂），产率分别为72%、47%和22%。

**2.2 金属配合物的合成与表征**：合成[Mn(TE-2)]⁺、[Mn(TE-5)]和[Mn(TE-6)]⁺，产率76%、94%、64%。SC-XRD显示[Mn(TE-2)]⁺存在单核水配位结构（水分子直接结合Mn²⁺）和多聚体结构（吡啶甲酸桥联），[Mn(TE-6)]⁺为扭曲七配位五角双锥构型，Mn-N键长显示仲胺键伸长以容纳臂。

**2.3 质子化、稳定常数和动力学惰性的测定**：UV-Vis滴定得出TE-2、TE-5、TE-6的质子化常数，TE-2最碱性（logK_HL 9.64）；金属形成常数显示TE-6最高logK_MnL 18.57，优于临床候选PyC3A（14.14）；pMn值[Mn(TE-2)]⁺为9.72。动力学惰性实验中，[Mn(TE-2)]⁺在25当量Zn²⁺下解离速率1.0×10^-5 s^-1（t_1/2 1155 min），远优于[Mn(TE-5)]（1:1 Zn²⁺下t_1/2 49 min）和[Mn(TE-6)]⁺（t_1/2 6 min），且比[Mn(BPPA)]（t_1/2 140 min）慢约10倍，表明N-甲基化显著增强惰性。

**2.4 Mn配合物的电化学性质**：CV和DPV测定Mn²⁺/Mn³⁺氧化电位。[Mn(TE-2)]⁺电位0.904 V vs Ag/AgCl（1.113 V vs NHE），高于O₂/H₂O还原电位（0.611 V vs Ag/AgCl），表明抗氧化性强。[Mn(TE-5)]和[Mn(TE-6)]⁺电位稍低（0.756和0.752 V vs Ag/AgCl），归因于吡啶基团电子效应。

**2.5 Mn配合物的弛豫性质**：弛豫率测定（1.4 T，33°C）显示[Mn(TE-2)]⁺为2.9 mM^-1s^-1，与[Mn(BPPA)]（2.8 mM^-1s^-1）相近，高于[Mn(PyC3A)]（1.5 mM^-1s^-1）。加BSA后各配合物弛豫率显著增大。[Mn(TE-2)]⁺与BSA结合常数K_a=3.62×10³ M^-1。 ¹⁷O测量得[Mn(TE-2)]⁺水合数q=0.5（存在q=1和q=0两种物种），水交换速率k_ex=0.05×10⁷ s^-1；[Mn(TE-5)]的q=0.5，k_ex=9.37×10⁷ s^-1；[Mn(TE-6)]⁺的q=0.2，k_ex=33.2×10⁷ s^-1，符合不同配位数和空间效应。

**2.6 体内MRI研究**：选择[Mn(TE-2)]⁺进行小鼠成像（9.4 T）。注射后信号渐增，主要在肾脏和膀胱，归一化信号分析显示肾清除为主，肝脏和心脏对比增强低，表明无显著白蛋白结合，体内保持完整。

结论部分：研究人员合成了三种新型不对称二氮杂吡啶并菲啶基配体（螯合臂和配位性不同），以鉴定合适的Mn²⁺ MR试剂。分光光度滴定表明这些配体具有与现有化合物相当的热力学稳定性。七配位配体TE-5和TE-6对Mn²⁺亲和力高于六配位TE-2。然而，[Mn(TE-2)]⁺的动力学惰性高于[Mn(TE-5)]和[Mn(TE-6)]⁺，表明增加配位数可能通过促进Zn²⁺介导的跨金属化而降低惰性。值得注意的是，骨架仲胺的甲基化显著改善了动力学惰性，[Mn(TE-2)]⁺与Zn²⁺的跨金属化速率约比[Mn(BPPA)]慢十倍。[Mn(TE-2)]⁺还显示出有利的弛豫性和动力学惰性，促进了体内评价。小鼠MRI成像表明该配合物在体内保持完整，主要通过肾脏和膀胱排泄，支持其进一步双功能修饰的潜力。