十钒酸酯-溶菌酶复合物的热力学性质、结构及其抗菌活性

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Thermodynamics, structure, and antibacterial activity of the decavanadate-lysozyme complex

　　

Ola Grabowska | Martyna Kapica | Anna Kloska | Krzysztof ?amoj? | Aleksandra Tesmar | Magdalena Zdrowowicz | Sergey A. Samsonov | Dariusz Wyrzykowski

格但斯克大学化学系，Wita Stwosza 63号，80-308 格但斯克，波兰

摘要

本研究利用溶菌酶-十钒酸盐（[V₁₀O₂₈]^6?）体系作为模型，探讨了高电荷聚阴离子对蛋白质结构和功能的影响。为了阐明这些相互作用的热力学、结构和功能后果，我们采用综合实验和计算方法对其进行了全面表征，包括等温滴定量热法（ITC）、稳态荧光光谱（SF）、电喷雾离子化质谱（ESI-MS）、圆二色光谱（CD）以及分子动力学（MD）模拟。通过ITC和SF数据证实，在pH 5.0时形成了2:1的([V₁₀O₂₈]^6?:溶菌酶)复合物，MD模拟显示其主要结合位点位于蛋白质的带正电的C末端区域。该复合物主要通过静电相互作用稳定，这与观察到的焓驱动的结合热力学结果一致。CD光谱分析表明，结合事件引发了溶菌酶的显著构象变化，主要表现为α-螺旋结构的减少。尽管发生了这种结构重排，溶菌酶的催化活性基本未受影响。最后，生物学测试显示，[V₁₀O₂₈]^6?与溶菌酶的混合物表现出比单独组分更强的抗菌活性，尤其是对革兰氏阳性菌（B. subtilis, S. aureus）的杀菌效果更为显著。

引言

多金属氧酸盐（POMs）是一类结构多样的金属-氧簇，具有广泛的生物活性，包括抗病毒[1]、抗菌[3]、[4]和调节酶的作用[5]。由于其多样的生物医学活性，POMs受到了广泛关注[5]，例如群体感应和抗生物膜效应[6]、抗癌和抗病毒特性[7]，以及环境修复应用[8]。这种生物潜力源于它们独特的结合和调节蛋白质活性的能力[9]、[10]。POMs调节蛋白质结构、稳定性和功能的能力是其生物效应的基础[11]、[12]。高电荷的十钒酸盐离子（[V₁₀O₂₈]^6?）是这类物质中的关键模型，因其结构明确、分子尺寸较大且整体带负电荷而非常适合用于研究聚阴离子-蛋白质相互作用。十钒酸盐离子([V₁₀O₂₈]^6?)在酸性至微酸性环境（pH约2.0–6.0）中非常稳定[13]，这有利于其与生物大分子的相互作用。这种相互作用主要由高负电荷簇与蛋白质表面带正电区域之间的静电吸引力驱动，这些带正电区域通常位于赖氨酸、精氨酸和质子化组氨酸等碱性氨基酸残基附近，为结合提供了有利的位置[14]、[15]。这些区域通常是灵活的环状结构或末端结构，而不是刚性核心。当配体结合时，灵活的区域更容易发生构象变化，从而影响蛋白质的性质。

许多研究表明，十钒酸盐离子对多种蛋白质具有亲和力，包括Ca²⁺-ATP酶[16]、收缩蛋白（如肌动蛋白[17]和肌球蛋白[18]）以及转运蛋白（如转铁蛋白[19]和血清白蛋白[20]）。虽然已知这些相互作用主要是由静电力驱动的，但对其分子层面的详细理解（包括热力学、结构变化和功能结果）仍然不足。为了解决这一问题，我们选择溶菌酶作为理想的阳离子模型蛋白，对其与十钒酸盐的相互作用进行了多技术综合研究，旨在阐明POM-蛋白质结合的基本机制及其后果。

溶菌酶特别适合用于研究多金属氧酸盐-蛋白质相互作用[21]、[22]、[23]。它具有明确的结构，在酸性pH下由于等电点（pI约11）而带有较高的正电荷，并且含有大量碱性氨基酸，这些氨基酸是聚阴离子的主要结合位点。最重要的是，溶菌酶对细菌细胞壁的明确酶促作用为评估配体结合如何调节生物活性提供了直接的方法。

在本研究中，我们以十钒酸盐（[V₁₀O₂₈]^6?）-溶菌酶体系为模型，探讨了聚阴离子结合对蛋白质结构和功能的影响。报告了结合的化学计量比、亲和力及热力学性质、结合位点的定位、分子间相互作用的表征，以及十钒酸盐引起的溶菌酶构象变化的量化。此外，我们还评估了这些结构变化是否影响溶菌酶的催化活性，并比较了十钒酸盐-溶菌酶混合物对革兰氏阳性菌（B. subtilis, S. aureus）和革兰氏阴性菌（E. coli, P. aeruginosa）的抗菌活性。据我们所知，这是首次对十钒酸盐-溶菌酶复合物进行的热力学-结构-功能综合研究，提供了合理设计基于多金属氧酸盐的抗菌剂所需的定量数据。

章节摘录

材料

使用了来自鸡蛋白的溶菌酶（透析、冻干、粉末形式，CAS: 12650–88-3，Sigma-Aldrich，波兰）、三水合醋酸钠（≥98%，CAS: 6131-99-3，Sigma-Aldrich，波兰）和乙酸钠（≥99.0%，CAS: 127–09-3，Sigma-Aldrich，波兰），无需额外纯化。制备缓冲液时使用电导率不超过0.18 μS cm^?1的双蒸水。十钒酸铵(V) ([NH₄)₆[V₁₀O₂₈](H₂O)₆)的合成方法参照先前描述进行

十钒酸盐-溶菌酶相互作用 - 化学研究

为了从分子层面理解十钒酸盐与溶菌酶之间的相互作用，采用了等温滴定量热法（ITC）。由于[V₁₀O₂₈]^6?离子在酸性环境（pH约2.0–6.0）中非常稳定[13]，实验在pH 5.0下进行。需要注意的是，ITC获得的热力学参数可能受实验条件（如pH值和缓冲液组成）的影响，尤其是在研究涉及蛋白质或配体的相互作用时

结论

通过结合互补的实验方法（ITC、SF、CD）和计算机分子动力学模拟，本研究阐明了溶菌酶与十钒酸盐聚阴离子([V₁₀O₂₈]^6?)之间相互作用的分子机制。主要发现如下：

• 1.
  这种相互作用是非特异性的，由静电力驱动，在pH 5.0时形成稳定的2:1 ([V₁₀O₂₈]^6?:溶菌酶)复合物，结合常数范围为
  10⁵–10⁶?M^?1。
• 2.
  一个明确的

CRediT作者贡献声明

Ola Grabowska：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究，资金获取，数据分析，概念化。Martyna Kapica：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究，数据分析。Anna Kloska：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究，数据分析，概念化。Krzysztof ?amoj?：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究，数据分析。Aleksandra

利益冲突声明

作者们没有与本文内容相关的利益冲突需要声明。

致谢

本工作得到了格但斯克大学“2024年青年科学家计划”（资助编号：539-T090-B203-25；O.G.）和波兰国家科学中心（资助编号：UMO-2023/49/B/ST4/00041；S.A.S.）的支持。