血红素衍生物的亲水性会影响MnSOD中特定位点的酪氨酸硝化反应

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Hydrophilicity of heme derivatives influences site-specific tyrosine nitration in MnSOD

　　

叶慧贤|刘一清|周太平|肖斌|高忠红|李海玲

中国华中科技大学化学与化学工程学院生物无机化学与药物材料湖北省重点实验室，武汉430074，中华人民共和国

摘要

酪氨酸硝化是一种关键的翻译后修饰，与多种氧化应激相关疾病有关。然而，控制位点选择性的因素尚未完全明了。在病理条件下，锰超氧化物歧化酶（MnSOD）的Tyr34位点特别容易发生硝化，这显著影响了其酶活性。先前的研究表明，过氧亚硝酸盐能够有效硝化MnSOD中的Tyr34，而在H₂O₂^?系统中，乳过氧化物酶（LPO）介导的硝化作用在该位点的反应性较低。因此，过氧亚硝酸盐诱导的硝化通常与MnSOD的失活相关在体内。我们假设硝化催化剂的亲水性会影响酪氨酸位点的选择性。为了验证这一点，我们比较了疏水性血红素、亲水性血红素类似物FeTPPS以及血红素与亲水性人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）形成的复合物所诱导的硝化情况。这三种硝化剂均能硝化MnSOD中的四个酪氨酸残基（Tyr2、Tyr9、Tyr11和Tyr34）。其中，FeTPPS引起的Tyr34硝化程度最高（40.1%），超过了过氧亚硝酸盐（23.6%），而血红素和heme-hIAPP引起的硝化程度较低（分别为16.8%和19.4%），这突显了血红素亲水性对硝化位点选择性的影响。硝化后MnSOD的活性显著下降，其中FeTPPS导致的下降最为明显。荧光光谱和分子对接分析表明，血红素和FeTPPS都结合在Tyr34附近，血红素主要通过疏水作用、π–π堆积和氢键结合，而FeTPPS则主要通过静电相互作用结合。血红素-hIAPP复合物也结合在Tyr34附近。与FeTPPS相比，血红素的结合降低了Tyr34周围的亲水性，从而抑制了其硝化。这些结果证实了血红素亲水性在蛋白质酪氨酸硝化选择性中的关键作用。

引言

蛋白质酪氨酸硝化是指蛋白质中酪氨酸（Tyr）残基的酚羟基邻位氢原子被硝基取代，形成3-硝基酪氨酸（3-NT）的过程[1–3]。自20世纪90年代以来，酪氨酸硝化已被认为是蛋白质的重要翻译后修饰，并因其与神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病等疾病的关联而受到广泛研究[4]。体外和体内的研究均证明了蛋白质中酪氨酸硝化位点的选择性[7, 8]。特定位点的酪氨酸硝化会导致蛋白质结构和功能的改变。Jiao等人的研究表明，在人血清白蛋白的18个酪氨酸残基中，只有2个对硝化特别敏感[9]。Díaz-Moreno等人发现，在细胞色素C（Cc）的5个酪氨酸残基中，只有Tyr67、Tyr74和Tyr97在体内发生硝化，而Tyr46和Tyr48保持未修饰[10]。

组织蛋白质中酪氨酸硝化位点的分析表明，其位置受多种因素影响：（1）蛋白质的类型和结构：蛋白质α-螺旋中的酪氨酸残基更容易发生硝化[7]；（2）硝化机制[11,12]：不同的硝化途径导致多种硝化模式[13]，从而影响硝化位点的选择性；（3）活性氧（ROS）水平的升高会增加蛋白质对酪氨酸硝化的敏感性[14, 15]；（4）酪氨酸残基受其局部微环境的影响。靠近带电氨基酸或位于环结构内的酪氨酸残基具有更高的硝化潜力，尤其是当它们与赖氨酸和谷氨酸等带电氨基酸相邻时[16]。Sacksteder等人[17]观察到，小鼠脑蛋白中的酪氨酸硝化经常发生在含有正电荷氨基酸的肽段中。Ng等人[16]通过动态模拟表明，硝基酪氨酸残基的溶剂可及性增强。此外，极性和碱性环境、空间位阻的减少（缺乏相邻的大脂肪族或芳香族残基）以及高溶剂可及性也有利于酪氨酸硝化[18]。蛋白质中特定酪氨酸残基的硝化足以引起结构和功能变化[7]。因此，进一步研究酪氨酸硝化位点的选择性和机制将有助于我们更好地理解体内的蛋白质酪氨酸硝化模式。

锰超氧化物歧化酶（MnSOD）是一种抗氧化酶，在真核生物和许多原核生物的线粒体基质中普遍存在[19]。它极易发生酪氨酸硝化，Tyr34位点的硝化会降低其催化活性[20?23]。Surmeli等人[24]报告称，过氧亚硝酸盐（ONOO^?）能有效硝化MnSOD的Tyr34，而含有血红素的乳过氧化物酶对该特定残基的硝化反应性较低。因此，ONOO^?是体内通过酪氨酸硝化导致MnSOD失活的主要因素。实际上，在神经退行性疾病、糖尿病和炎症等病理条件下，活性氧和氮物种的水平升高伴随着血红蛋白中游离血红素的释放或血红素-淀粉样复合物（例如血红素-Aβ）的形成[25–27]。这些血红素衍生物在H₂O₂和NO₂^?存在下也能催化蛋白质酪氨酸硝化，这一途径与ONOO^?介导的硝化不同[28, 29]。此外，我们之前的研究表明，疏水性血红素和亲水性血红素类似物5,10,15,20-四（4-磺苯基）卟啉铁氯化物（FeTPPS）催化的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酪氨酸硝化会导致不同的硝化位点。推测这是由于血红素和FeTPPS的亲水性差异所致[30]。为了进一步研究硝化剂的亲水性与其硝化位点之间的关系，本研究以MnSOD为靶蛋白，因为MnSOD的硝化位点与酶活性之间存在明确的关系。血红素、FeTPPS以及血红素与亲水性人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）形成的复合物作为酪氨酸硝化催化剂，以确定它们对MnSOD中酪氨酸硝化位点选择性的影响。理论计算模拟了蛋白质结构、酪氨酸残基微环境和蛋白质溶剂可及性对三种硝化剂催化后MnSOD酪氨酸硝化位点的影响。分子对接模拟分析了硝化剂与MnSOD之间的相互作用，以解释硝化位点的选择性。本研究旨在利用MnSOD作为模型蛋白，阐明催化剂亲水性如何调控酪氨酸硝化位点的选择性，并为理解体内的蛋白质酪氨酸硝化提供理论基础。

章节片段

材料

重组大肠杆菌 MnSOD购自Solebao Biotechnology Co., Ltd.；hIAPP（纯度>95%）购自China Peptides（上海）。三价铁原卟啉IX氯化物（以下简称“血红素”）、SIN-1（3-吗啉基辛诺咪嗪）、兔源多克隆抗3-NT抗体、序列级胰蛋白酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）由Sigma公司提供。FeTPPS由Frontier Scientific公司提供。

通过HR-LC-MS/MS分析体外硝化并溶解在溶液中的MnSOD，确定了3-硝基酪氨酸的存在和位置。对于血红素-NaNO₂-H₂₂硝化体系，检测到36个肽段，氨基酸序列覆盖率为98.05%。根据添加–NO₂后酪氨酸残基质量增加45 Da的现象，鉴定出多个3-NT残基。

讨论

结论

叶慧贤：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取、正式分析、概念构思。刘一清：撰写 – 初稿撰写、可视化、验证、方法学研究、调查、正式分析、数据管理。周太平：可视化、验证、正式分析、数据管理。肖斌：撰写 – 审稿与编辑、正式分析。高忠红：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取、正式分析、概念构思。

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作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

国家自然科学基金（编号32171297, 32071282, 22377027 和 32060211）、江西省自然科学基金（编号20212BAB213021 和 20232BAB205024）以及井冈山大学博士研究基金（编号JZB1903）的资助。