伏隔核(Nucleus Accumbens, NAc)中ANKS1B通过调控CBP-FoxO3复合物控制可卡因自身给药的升级(Escalated Cocaine Self-Administration)

《Advanced Science》：ANKS1B in the Nucleus Accumbens Controls Escalated Cocaine Self-Administration via Regulating CBP-FoxO3 Complex

　　

从受控到升级的药物摄入转变是 cocaine使用障碍(Cocaine Use Disorder, CUD)的核心特征，但其行为升级背后的分子机制仍不明确。研究人员此前全基因组关联研究(Genome-Wide Association Study, GWAS)发现ANKS1B是海洛因、甲基苯丙胺和酒精依赖共有的显著遗传风险因子，提示其在成瘾易感性中具有广泛作用，但ANKS1B在可卡因成瘾中的具体功能及相关神经机制尚不清楚。本研究发现，长期可卡因使用后伏隔核(Nucleus Accumbens, NAc)中ANKS1B表达水平下调，操纵ANKS1B可选择性影响长期接触(Long-Access, LgA)可卡因自身给药大鼠模型中的可卡因摄入量升级及后续觅药行为。分子实验表明，ANKS1B与组蛋白乙酰转移酶CREB结合蛋白(CREB-Binding Protein, CBP)相互作用，通过表观遗传抑制转录因子叉头框蛋白O3(Forkhead Box O3, FoxO3)的转录，调控H3K27乙酰化(H3K27ac)及可卡因摄入量的升级。综上，结果表明ANKS1B是影响可卡因使用升级的关键因子，ANKS1B-CBP-FoxO3信号通路可作为控制长期可卡因使用的潜在治疗干预靶点。

《Advanced Science》刊载研究解读：伏隔核ANKS1B-CBP-FoxO3轴调控可卡因摄入升级的机制

研究背景与立项依据

可卡因使用障碍(Cocaine Use Disorder, CUD)是重要的公共卫生问题，目前尚无FDA批准的治疗药物。CUD的典型特征是长期可卡因暴露后从偶发性使用转变为强迫性、摄入量不断升高的成瘾行为，称为"摄入升级(escalation)"。长期接触(Long-Access, LgA, 6 h/天)而非短期接触(Short-Access, ShA, 2 h/天)可卡因自身给药范式可可靠模拟此成瘾样行为升级及随后的觅药欲望孵育(incubation of cocaine seeking)。既往研究表明多巴胺系统等参与该过程，但驱动可卡因摄入量升级的分子机制仍不清楚。锚蛋白重复域含蛋白1B(Ankyrin Repeat Domain-Containing Protein 1B, ANKS1B)是一种含锚蛋白重复序列的支架蛋白，调控突触可塑性与谷氨酸能信号及表观遗传转录程序，参与多种神经精神疾病。研究人员前期GWAS将ANKS1B常见变异鉴定为海洛因、甲基苯丙胺和酒精依赖的共享遗传风险因子，且长期药物暴露降低ANKS1B表达，腹侧被盖区过表达ANKS1B可减少药物自身给药，提示ANKS1B可能是成瘾易感性的保护性因子，但其在可卡因成瘾及NAc中的具体作用与机制未知。由于CUD病理受表观遗传调控（可卡因诱导组蛋白修饰重塑染色质改变基因表达），且ANKS1B可通过锚蛋白重复域偶联突触活动与染色质重塑，故研究人员假设NAc中ANKS1B通过调控表观遗传机制（特别是与具组蛋白乙酰转移酶Histone Acetyltransferase, HAT活性的CREB结合蛋白CREB-Binding Protein, CBP相互作用）调节可卡因使用。

主要关键实验方法概述

研究使用雄性Sprague-Dawley大鼠建立ShA(2 h/天×17天)与LgA(前7天2 h/天，后10天6 h/天)静脉可卡因自身给药模型；采用腺相关病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)和慢病毒(Lentivirus, LV)在NAc进行ANKS1B及FoxO3的过表达(Overexpression, OE)与敲低(Knockdown, KD)，Anks1b^f/f大鼠联合D1/D2-Cre实现中等棘突神经元(Medium Spiny Neurons, MSNs)亚型特异性敲除；通过开场实验(Open Field Test, OFT)、高架十字迷宫(Elevated Plus Maze, EPM)、新物体识别(Novel Object Recognition, NOR)及蔗糖自身给药排除非特异性行为影响；Golgi-Cox染色观察树突棘密度与分型，突触膜组分Western blot检测NMDA受体亚基NR2A/NR2B及AMPA受体亚基GluA1-3、PSD-95；免疫荧光观察细胞定位与共定位；Co-IP验证ANKS1B-CBP相互作用；AlphaFold3进行蛋白对接模拟；NAc组织Western blot检测总组蛋白及各乙酰化位点(H3K9ac、H3K14ac、H3K27ac、H3K56ac、H2BK12ac)；NAc取材RNA-seq筛选差异表达基因与KEGG通路分析，qPCR验证FoxO家族mRNA，染色质免疫沉淀-定量PCR(Chromatin Immunoprecipitation qPCR, ChIP-qPCR)检测CBP及H3K27ac在FoxO启动子富集度；侧脑室/NAc内微量注射CBP HAT抑制剂C646或FoxO抑制剂Carbenoxolone验证下游必要性；统计学采用单因素/双因素ANOVA及重复测量ANOVA配适Tukey或Bonferroni事后检验。

研究结果

2.1 Long- But Not Short-Access Cocaine Self-Administration Reduced ANKS1B Expression in the NAc（长期而非短期可卡因自身给药降低NAc中ANKS1B表达）

免疫荧光显示ANKS1B蛋白主要定位于NAc神经元(与NeuN共标)，极少见于星形胶质细胞(S100β?)和小胶质细胞(Iba-1?)。LgA大鼠出现典型可卡因摄入进行性升级，ShA大鼠无升级；LgA组NAc中ANKS1B蛋白水平较生理盐水对照组和ShA组显著降低，表明ANKS1B表达与可卡因摄入升级呈负相关。

2.2 Viral-Mediated Manipulation of ANKS1B Expression in the NAc Bidirectionally Regulated Escalated Cocaine Intake and the Subsequent Cocaine-Seeking Behavior（病毒介导NAc中ANKS1B操纵双向调控可卡因摄入升级及后续觅药行为）

NAc中AAV介导ANKS1B过表达不影响ShA期自身给药获得，但完全阻止LgA期摄入量随时间升高(无升级)，并降低戒断1天(WD1)和28天(WD28)后线索诱导的可卡因觅药；神经元特异性慢病毒过表达ANKS1B重现该效应。反之，AAV-shRNA敲低ANKS1B不影响ShA获得，却加速LgA期摄入升级，并增强WD1与WD28线索诱导觅药。单纯17天ShA下过表达或敲低均不改变稳定摄入量。D1-MSN或D2-MSN特异性敲除Anks1b均增加线索诱导觅药但不影响升级，提示NAc ANKS1B负向调控可卡因使用升级。

2.3 ANKS1B Modulation in the NAc did not Lead to Nonspecific Behavioral Suppression or Influence Sucrose Self-Administration（NAc中ANKS1B操纵不引起非特异性行为抑制也不影响蔗糖自身给药）

过表达或敲低ANKS1B不改变OFT中总运动距离与中央区停留时间、EPM中开臂/闭臂停留时间、NOR中新旧物体辨别比，且不影响ShA与LgA期蔗糖自身给药获得及WD1/WD28线索诱导蔗糖觅药，证实ANKS1B调控具有可卡因相关行为选择性，无泛化运动、焦虑或自然奖赏加工影响。

2.4 ANKS1B Overexpression Attenuated Long-Access Cocaine Intake-Induced Structural and Synaptic Plasticity（ANKS1B过表达减弱LgA可卡因诱导的结构与突触可塑性变化）

Golgi染色示LgA增加NAc MSNs总树突棘密度（尤细棘thin spines与蘑菇棘mushroom spines），ANKS1B过表达完全阻断此升高（主要逆转细棘增加）。Western blot示LgA降低突触后膜NR2A(N-methyl-D-aspartate Receptor subunit 2A, NMDA受体2A亚基)水平，ANKS1B过表达将其恢复；PSD-95、GluA1/2/3、NR2B无组间差异，表明ANKS1B可防止NAc与长期可卡因摄入相关的树突棘结构与NR2A分子重塑。

2.5 ANKS1B Interacts With the Histone Acetyltransferase CBP to Control H3K27 Acetylation and Extended Cocaine Intake（ANKS1B与CBP互作调控H3K27乙酰化及长期可卡因摄入）

NAc组织Co-IP与免疫荧光确认内源性ANKS1B与CBP物理互作并核内共定位；LgA降低ANKS1B-CBP结合，过表达恢复之。分子对接显示ANKS1B与CBP的Bro(bromodomain)、HAT、KIX域有预测稳定界面。LgA选择性升高NAc中H3K27ac，ANKS1B过表达完全阻止该升高；H3K9ac、H3K14ac、H3K56ac、H2BK12ac均无变化。NAc内注射CBP HAT特异性抑制剂C646不影响ShA获得，但抑制LgA升级及WD1/WD28线索诱导觅药，模拟ANKS1B过表达效应，说明ANKS1B作为CBP抑制性支架限制其HAT活性致H3K27ac升高。

2.6 ANKS1B Controls LgA Cocaine Intake-Induced FoxO3 Transcription（ANKS1B调控LgA可卡因诱导的FoxO3转录）

NAc RNA-seq比较显示LgA vs ShA上调1717个基因，其中604个LgA上调基因被ANKS1B过表达下调，KEGG富集最显著通路为FoxO信号通路。qPCR示仅FoxO3 mRNA在LgA升高并被ANKS1B过表达完全回降，FoxO1与FoxO6无变化。ChIP-qPCR示LgA增加CBP占位与H3K27ac富集于FoxO3启动子，ANKS1B过表达消除二者富集；FoxO1与FoxO6启动子无此变化，证明ANKS1B通过抑制CBP招募及H3K27ac抑制FoxO3转录激活。

2.7 FoxO3 is a Necessary Downstream Mediator of the ANKS1B Pathway for Cocaine-Related Behaviors（FoxO3是ANKS1B通路调控可卡因行为的必要下游介质）

NAc共过表达FoxO3可逆转ANKS1B过表达对LgA升级的抑制及WD1/WD28觅药抑制，恢复至对照水平。NAc内注射FoxO抑制剂Carbenoxolone不影响ShA获得，但减弱LgA升级及WD1/WD28线索诱导觅药。证实FoxO3是ANKS1B-CBP轴下游必要效应分子，介导可卡因摄入升级与觅药行为。

讨论与结论总结

本研究阐明ANKS1B作为前期GWAS鉴定的多物质成瘾共享风险基因，在可卡因成瘾中的因果作用与精确机制：长期(LgA)而非短期可卡因暴露特异地下调NAc中ANKS1B，双向操纵ANKS1B双向调控成瘾样升级与觅药且不干扰一般运动、焦虑、认知或自然奖赏加工。机制上，ANKS1B在核内与具HAT活性的CBP形成蛋白复合物并结合其Bro/HAT/KIX域，生理状态下限制CBP介导的H3K27乙酰化，表观抑制FoxO3启动子转录；长期可卡因致ANKS1B下调削弱ANKS1B-CBP互作，解除对CBP约束使其富集于FoxO3启动子并升高H3K27ac，上调FoxO3转录，促发NAc树突棘（细棘）增生与NR2A下调等病理性神经可塑性，驱动可卡因摄入升级与觅药。恢复ANKS1B、抑制CBP HAT活性(C646)或抑制FoxO3(Carbenoxolone)均可阻断该级联并阻止升级。结论：NAc中ANKS1B作为CBP的负性支架蛋白，通过ANKS1B-CBP-FoxO3信号轴调控H3K27ac及FoxO3转录，长期可卡因致ANKS1B缺失引发此表观遗传与转录去抑制，促进病理性可卡因使用升级；ANKS1B-CBP-FoxO3轴是控制病理性可卡因摄入的潜在新治疗靶点。