S1P受体1(S1PR1)调控小鼠皮层中竞争依赖性星形胶质细胞形态发生及平铺(Tiling)

《GLIA》：Sphingosine-1-Phosphate Receptor 1 Regulates Competition Dependent Astrocyte Morphogenesis and Tiling in Murine Cortex

　　

摘要：星形胶质细胞在哺乳动物脑内含量丰富，通过与神经元及其他胶质细胞协同作用，调控神经环路结构、功能及血脑屏障(BBB)完整性以维持脑稳态。星形胶质细胞的大部分功能依赖于其高度复杂的形态及数以万计的微细突起(process)，这些突起对接触神经元突触及其他胶质细胞至关重要。事实上，星形胶质细胞的形态复杂性受神经元存在及活性的调控，并有助于建立非重叠式的星形胶质细胞域/平铺(tiling)模式；然而星形胶质细胞平铺的分子机制尚不清楚。研究人员既往使用人星形胶质细胞-小鼠神经元共培养体系发现，1-磷酸鞘氨醇受体1(S1PR1，sphingosine-1-phosphate receptor 1)以神经元接触依赖方式调控星形胶质细胞形态发生。本研究中，研究人员发现S1PR1在体内也调控星形胶质细胞形态发生。通过使用星形胶质细胞特异性S1PR1基因敲除(KO)小鼠模型及腺相关病毒(AAV)标记法，研究人员证实S1PR1对发育中脑内竞争驱动的星形胶质细胞平铺及形态发生至关重要。此外，研究人员发现JAK-STAT3信号通路调控共培养体系中神经元接触诱导的星形胶质细胞S1PR1表达。因此，本研究揭示了一种脂质信号受体作为小鼠皮层中各层星形胶质细胞形态发生及平铺的主要调控因子。

论文解读：《GLIA》发表——S1P受体1(S1PR1)调控小鼠皮层中竞争依赖性星形胶质细胞形态发生及平铺(Tiling)

一、研究背景与立项依据

星形胶质细胞(astrocyte)是哺乳动物大脑中含量丰富的胶质细胞，通过其高度分支化的胞体及大量外周微细突起——突触周星形胶质细胞突起(PAPs，perisynaptic astrocytic processes)——与神经元、其他胶质细胞及血管形成交互网络，参与代谢支持、突触修剪、髓鞘化协助及血脑屏障(BBB)维持等重要功能。星形胶质细胞在大脑皮层中占据互不重叠的独立空间域，即平铺(tiling)，这种非重叠域的建立被认为受细胞间竞争或排斥机制调控，但其具体的分子信号机制仍不明确。已有研究表明神经元可诱导星形胶质细胞形态成熟，且研究人员前期工作发现1-磷酸鞘氨醇受体1(S1PR1，sphingosine-1-phosphate receptor 1)在体外共培养体系中以神经元接触依赖方式促进星形胶质细胞形态发生，但S1PR1在哺乳动物体内星形胶质细胞形态发生及平铺中的作用尚未阐明。为此，研究人员通过构建星形胶质细胞特异性S1PR1敲除小鼠，结合AAV稀疏标记、体外共培养及药理学抑制等手段，探究S1PR1在发育中小鼠皮层星形胶质细胞形态建成与域竞争中的功能及上游调控机制。

二、主要关键技术方法

研究使用C57BL/6J背景小鼠，包括S1PR1^loxP/loxP与GFAP-Cre杂交获得的星形胶质细胞特异性S1PR1敲除(S1PR1^ΔAST)小鼠、S1PR1^GFP/GFP报告小鼠及Rosa26^{loxP-STOP-loxP-Cas9-P2A-GFP}Cre报告小鼠；原代皮层神经元与星形胶质细胞分别取自P1和P3野生型或S1PR1^GFP/GFP新生鼠进行单培养或共培养，药理学干预使用S1PR1拮抗剂W146、JAK2抑制剂Ruxolitinib及Smoothened抑制剂Sonidegib；体内通过P2–P3小鼠颅内注射AAV-GfaABC₁D-YFP（全层标记）、AAV-GfaABC₁D-Lck-GFP（膜标记）及AAV-GfaABC₁D-YFP-P2A-Cre/tdTomato-P2A-Cre（稀疏标记兼条件性敲除）；脑切片行免疫荧光染色；星形胶质细胞三维形态学通过Zeiss共聚焦显微镜采集Z-stack图像，使用Imaris进行表面与丝状(filament)重建、凸包(convex hull)生成以分析胞体体积、领土(territory)体积、丝状长度/面积及Sholl相交数；相邻星形胶质细胞领土重叠通过Imaris共定位模块量化；体外S1PR1表达量以GFP荧光强度反映；统计学采用Welch's t检验或ANOVA。

三、研究结果

3.1 Astrocyte Morphology and S1PR1 Expression Are Driven by Neuronal Contact In Vitro（体外神经元接触驱动星形胶质细胞形态及S1PR1表达）

将S1PR1^GFP/GFP原代星形胶质细胞与野生型神经元共培养，根据是否与MAP2⁺神经元突起接触分为接触组(IA)与非接触组(NIA)。结果显示与神经元接触的星形胶质细胞S1PR1-GFP荧光强度升高，周长(perimeter)增大，Sholl相交数增多，表明神经元接触同时上调S1PR1表达并促进形态复杂化。S1PR1特异性拮抗剂W146处理共培养体系后，接触诱导的S1PR1表达上调及形态复杂性增加均被抑制，证实S1P–S1PR1轴介导此过程。进一步用JAK2抑制剂Ruxolitinib处理可阻断神经元接触诱导的S1PR1表达上调及形态复杂化，而Sonic hedgehog(SHH)通路抑制剂Sonidegib仅影响形态复杂性但不影响S1PR1表达，说明神经元接触通过JAK-STAT3而非SHH信号诱导星形胶质细胞中S1PR1的表达。

3.2 Astrocyte-Specific S1PR1 Knockout Mice Exhibit No Gross Changes in Blood Vasculature, Astrocyte Maturation and Astrocyte Numbers（星形胶质细胞特异性S1PR1敲除小鼠血管、星形胶质细胞成熟度及数量无明显改变）

S1PR1^ΔAST小鼠皮层S1PR1 mRNA及蛋白水平显著降低，但血管内皮CD31⁺细胞上S1PR1表达保留。免疫荧光显示AQP4⁺终足(endfoot)及CD31⁺血管信号无变化；尾静脉注射1 kDa尸胺(cadaverine)或3 kDa葡聚糖(dextran)示踪剂，脑内滞留量与对照组无差异，表明星形胶质细胞S1PR1缺失不影响BBB完整性。SOX9⁺OLIG2^?星形胶质细胞计数无差异；GFAP荧光强度及结构无变化；突触周标志物GLT-1(GFAP-linked glutamate transporter-1，由Slc1a2编码)斑点(puncta)数量与体积无差异，提示S1PR1缺失不影响基础星形胶质细胞数量、成熟状态及PAP标志分子表达。

3.3 S1PR1 KO Astrocytes Exhibit Altered Morphology and Complexity In Vivo（S1PR1敲除星形胶质细胞在体内呈现形态与复杂性改变）

P2–P3注射AAV-GfaABC₁D-YFP标记S1PR1^ΔAST及对照小鼠皮层Ⅱ–Ⅲ层(L2-3)星形胶质细胞，P30取材行3D重建。L2-3 S1PR1^ΔAST星形胶质细胞总体积、胞体体积及领土(territory)体积显著增大，丝状总长度与总面积无变化，Sholl分析示距胞体>20 μm处相交数增加，即远端分支增多。L4–5层星形胶质体细胞总体积、胞体体积、领土体积、丝状长度/面积均无显著差异，但Sholl分析示距胞体20–40 μm处相交数减少，提示中间段分支略减。结果表明S1PR1限制L2-3星形胶质细胞领土扩张并促进正常分支模式，而对深层星形胶质细胞影响较轻微且具有层特异性(lamina-specific)。

3.4 Membrane-Tagged GFP Filled S1PR1 KO Astrocytes Exhibit Altered Complexity In Vivo（膜标记GFP填充的S1PR1敲除星形胶质细胞在体内呈现复杂性改变）

使用AAV-GfaABC₁D-Lck-GFP膜标记后发现L2-3 S1PR1^ΔAST星形胶质细胞Sholl分析同样显示>20 μm处相交数增加；L4-5 S1PR1^ΔAST星形胶质细胞15–30 μm处相交数减少，与胞质YFP填充结果一致，验证了S1PR1敲除致L2-3远端分支增多、L4-5中间段分支略减的结论，排除填充方式造成的偏差。

3.5 Sparse Knockout of S1PR1 in the Upper Cortical Layers Reduces Astrocyte Morphology and Complexity（上层皮层稀疏敲除S1PR1导致星形胶质细胞形态与复杂性减小）

向S1PR1^fl/fl新生鼠注射AAV-GfaABC₁D-YFP-P2A-Cre实现单个/稀疏星形胶质细胞S1PR1条件性敲除，对照注射AAV-GfaABC₁D-YFP。L2-3稀疏敲除的单个星形胶质细胞体积、领土体积、丝状长度/面积均小于对照，Sholl相交数减少；L4-5稀疏敲除单个星形胶质细胞体积与领土体积亦减小，Sholl相交数降低。该结果与全局敲除相反但与体外敲除及竞争假说相符：当邻近野生型星形胶质细胞存在S1PR1时，S1PR1缺失细胞在竞争中处于劣势，无法扩展其领土与分支，表明S1PR1参与竞争依赖性星形胶质细胞生长与平铺。

3.6 S1PR1 Regulates Astrocyte Territorial Overlap/Tiling（S1PR1调控星形胶质细胞领土重叠/平铺）

共注射YFP-P2A-Cre + tdTomato-P2A-Cre至S1PR1^fl/fl幼鼠使相邻两星形胶质细胞均敲除S1PR1（KO:KO），对照共注射YFP + tdTomato（WT:WT）。成像相邻标记对(tiling pair)，Imaris凸包界定各细胞领土并计算重叠体积。WT:WT相邻星形胶质细胞领土重叠极少；KO:KO相邻对显示显著增大的领土重叠体积（归一化后），且两细胞胞体间距无差异。证明S1PR1是建立非重叠平铺所必需，缺失时相邻星形胶质细胞无法相互排斥，出现竞争缺陷性域重叠。

四、讨论与结论总结

讨论指出：(1)体外实验表明神经元接触通过JAK-STAT3信号（而非SHH）上调星形胶质细胞S1PR1表达，S1P–S1PR1轴进而经Rac/Rho GTP酶调控肌动蛋白重塑以促进突起分支与PAP形态发生；(2)体内S1PR1对星形胶质细胞形态的影响呈层特异性，L2-3作用显著，可能与S1PR1在上层富集、深层星形胶质细胞成熟较早或受其他黏附/因子补偿有关；(3)全局敲除致L2-3星形胶质细胞领土扩大系因所有邻近细胞均失去竞争排斥能力，无法相互限制；稀疏敲除则使缺失细胞在野生型邻居竞争中退缩，证实S1PR1介导竞争依赖性平铺；(4)S1PR1可能通过内化降解S1P参与胞外S1P梯度形成与维持，类比免疫细胞中S1P梯度调控细胞迁移的机制，为星形胶质细胞域划分提供脂质梯度基础。

研究结论翻译：

本研究证明脂质信号受体1-磷酸鞘氨醇受体1(S1PR1)在体外受神经元接触通过JAK-STAT3信号诱导表达，并以神经元接触依赖方式促进星形胶质细胞形态发生；在体内S1PR1是小鼠皮层发育中竞争驱动星形胶质细胞平铺(tiling)及形态发生的关键调控因子，其缺失导致相邻星形胶质细胞间无法维持非重叠领土、出现异常域重叠。S1PR1可能通过调节细胞骨架重塑及胞外S1P水平参与星形胶质细胞域竞争，为理解脑内神经-胶质网络组装及稳态维持提供了新机制视角。