伞形科蔬菜对全西方饮食及葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎的保护作用

《The Journal of Nutrition》：Protective effect of apiaceous vegetables against Total Western Diet- and dextran sulfate sodium-induced colitis in mice

　　

西方型膳食模式与结肠炎及结肠癌相关。现有数据表明，摄入伞形科蔬菜（API；如芹菜、欧防风）可能预防炎症相关疾病。研究人员旨在评估API补充全西方饮食（TWD）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎的影响。8周龄雄性C57BL/6J小鼠（15只/组）被喂食含21%或42%新鲜API（w/w）的TWD，并给予2%DSS以诱导结肠炎。监测摄食量、体重及疾病活动指数（DAI）。收集血清进行细胞因子/趋化因子分析，结肠组织进行组织学及蛋白质免疫印迹（Western blot）检测。粪便样本通过16S rRNA基因测序以及靶向/非靶向代谢组学进行分析。表型数据采用方差分析（ANOVA）结合Tukey检验进行分析。微生物组数据经中心对数比（CLR）转换后，使用线性混合模型及校正后的成对比较进行分析。API补充缓解了结肠炎表型，包括体重减轻（44%恢复；P < 0.001）、结肠缩短（57%恢复；P < 0.01）、疾病活动度（降低59%；P < 0.001）、细胞因子/趋化因子释放（降低35%-73%；P < 0.05）以及黏膜F4/80⁺细胞浸润（减少80%；P < 0.001）。API还改善了肠道微生物群的多样性和组成，增加α多样性指标（4.4%-13.8%；P < 0.05），抑制致病菌（Paraclostridium、Enterococcus、Eubacterium；估计CLR差值：-1.8至-6.7；P < 0.001），并富集有益菌（Lachnospiraceae和Blautia；估计CLR差值：+1.6至+3.0；P < 0.05）。此外，代谢组学显示TWD摄入增加了花生四烯酸和脂肪族醛类（增加109%-510%；P < 0.001），并降低了短链及不饱和脂肪酸（降低30%-91%；P < 0.001）。API补充还缓解了TWD来源的功能性代谢物（包括胆汁酸；P < 0.05）。上述数据表明，API摄入有利于降低与西方饮食相关疾病的风险。然而，仍需进一步研究以明确这些有益效应背后的机制。

西方型膳食模式是炎症性肠病（IBD）及伴随的肠道微生态失调（gut dysbiosis）的主要环境危险因素，亦被视为结直肠癌的"推定因素"。全西方饮食（TWD）是一种能够反映美国人平均宏量和微量营养素摄入的实验啮齿动物饲料。尽管伞形科（Apiaceae）蔬菜中的聚乙炔类环氧脂素——镰叶醇（falcarinol）和镰叶二醇（falcarindiol）在多种模型中具有抗炎和抗肿瘤效应，但关于伞形科蔬菜整体摄入对西方饮食相关疾病及肠道微生态失调影响的数据仍然匮乏。为此，研究人员评估了伞形科蔬菜摄入是否以剂量依赖性方式保护TWD喂养小鼠抵御实验性结肠炎，并考察其对肠道微生物组成及功能（即代谢物谱）的影响。

该研究采用的主要关键技术方法包括：（1）动物实验模型：以TWD为基础饲料，对C57BL/6J雄性小鼠进行21%或42%伞形科蔬菜（芹菜与欧防风等量混合）补充，并通过2%DSS饮水建立急性结肠炎模型；（2）表型与组织学评估：监测体重、疾病活动指数（DAI）、结肠长度/重量比，并进行苏木精-伊红（H&E）染色、阿尔辛蓝（Alcian blue）黏液层染色及免疫荧光检测F4/80⁺巨噬细胞浸润；（3）分子生物学检测：运用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测紧密连接蛋白occludin表达，采用蛋白质组学分析阵列（Proteome Profiler Array）检测血清细胞因子/趋化因子谱；（4）16S rRNA基因测序微生物组分析：对V4区进行Illumina MiSeq测序，采用稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）和线性混合模型进行群落结构及物种水平分析；（5）代谢组学分析：包括靶向短链脂肪酸（SCFA）定量（采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术UPLC-QTOFMS）及非靶向代谢组学（主成分分析PCA和偏最小二乘判别分析PLS-DA建模）。

API缓解DSS诱导的结肠炎：在DSS挑战期间，TWD+DSS组小鼠出现腹泻和直肠出血导致的体重下降，而TWD+21%API+DSS组和TWD+42%API+DSS组的净体重增长较TWD+DSS组显著改善（P < 0.001），分别达2.8±1.2 g和3.0±1.3 g（TWD+DSS组为0.4±1.6 g，TWD组为6.3±1.9 g）。API补充以剂量依赖方式减弱了DSS诱导的DAI升高。DSS诱导的结肠缩短及结肠重量/长度比增加亦被21%和42% API补充所改善。

API补充改善细胞因子/趋化因子谱：TWD+42%API+DSS组脾脏重量低于TWD+DSS组。DSS挑战使脾脏指数升高（TWD+DSS组0.4±0.2% vs TWD组0.2±0.1%，P < 0.001），而在TWD+21%API+DSS（0.3±0.1%，P < 0.05）和TWD+42%API+DSS（0.2±0.1%，P < 0.001）中逆转。血清中IL-2、IL-4、IL-7、IL-13、IL-17A和IL-27在TWD+DSS组降低，而被API补充逆转。生长因子M-CSF降低和G-CSF升高的变化亦被API逆转。CXCL型趋化因子 courses（CXCL1、CXCL9、CXCL13）升高而CXCL12降低的趋势同样在API补充组得到逆转。

API保护结肠黏膜抵御DSS诱导的损伤及F4/80⁺细胞浸润：TWD+DSS组出现结构性黏膜损伤，API补充改善其外观至接近未挑战DSS组。TWD+DSS组阿尔辛蓝染色黏液面积极少，而TWD+21%API+DSS和TWD+42%API+DSS组显著恢复。紧密连接蛋白occludin在TWD+DSS组几乎检测不到，而在TWD+42%API和TWD+42%API+DSS组改善。TWD+DSS组F4/80⁺细胞浸润增加，被API补充所抑制，表明API预防了DSS诱导的肠道屏障损伤并抑制了炎症反应。

API缓解TWD/DSS诱导的肠道微生物多样性改变：第17天时，DSS诱导了微生物群落结构在门水平的明显分离（62.2%变异），而API补充在DSS挑战下无显著门水平效应。属水平上，API补充在无DSS的小鼠中于第12天和第17天形成与TWD不同的聚类；在DSS挑战小鼠中，API补充于第17天亦与TWD+DSS分离。校正基线后，TWD+21%API和TWD+42%API的ACE、Chao1、Fisher和Observed ASVs较TWD增加；Shannon和Simpson指数仅在TWD+21%API增加。DSS挑战下，两组API的Chao1、Shannon和Simpson指数均高于TWD+DSS。

API喂养促进有益肠道微生物组成：DSS在所有组中富集了Bacteroides和Parasutterella，但耗竭了Lachnospiraceae A2、Eubacterium xylanophilum组和Roseburia。与TWD相比，DSS增加了Paraclostridium和Enterococcus，降低了Lachnospiraceae NK4A136组、Muribaculaceae和Turicibacter。在无DSS小鼠中，API增加了Eubacterium xylanophilum组、Lachnospiraceae FCS020组和Ruminococcus。DSS挑战下，API增加了Blautia、Lachnospiraceae FCS020、Lachnospiraceae NK4A136、Muribaculaceae、Oscillibacter和Turicibacter，减少了Adlercreutizia、Enterococcus、Eubacterium nodatum组、Lactobacillus和Paraclostridium。

API摄入诱导的粪便代谢组差异：除异戊酸外，所有SCFA在TWD消耗12天后均降低。虽然API摄入未增加最终SCFA浓度，但从第0天到第12天的变化来看，TWD+21%API和TWD+42%API缓解了TWD单独喂养小鼠中乙酸的降低；TWD+21%API亦减弱了丁酸和戊酸的降低。非靶向代谢组学显示，第12天所有饮食组的花生四烯酸和醛类（乙醛、丁醛、戊醛、丙烯醛）增加，而不饱和脂肪酸（棕榈油酸、α-亚麻酸、亚油酸、油酸、二十碳五烯酸）和SCFA（乙酸、丁酸）降低。PLS-DA模型显示各组代谢物差异聚类。与TWD相比，TWD+42%API富集了α-亚麻酸、亚油酸和羟基十八烷酸。TWD增加但被API逆转的代谢物包括胆酸、α-鼠胆酸、甲硫氨酰丝氨酸、丙酮和对羟基苯乙酸。

讨论部分指出，西方饮食模式是结直肠健康和肠道微生物组成的关键环境影响因素。TWD的设计旨在模拟美国膳食模式，其特点是高度加工精制食品、高糖高盐高脂、红肉为主要蛋白来源，与典型AIN-93G饲料相比，复杂碳水化合物和蛋白质较少但简单糖约高2.6倍，脂肪约高两倍，且脂肪来源更为多样，同时多种微量营养素如钙、铜、叶酸、硫胺素、胆碱及维生素B6、B12、D、E较低，但钠约高6倍。该饮食可加剧DSS诱导的结肠炎和炎症相关结直肠癌的发生，并改变肠道微生物组。

研究人员发现，API补充以相当于人类每日约128 g（约1杯或37 kcal）的剂量，即可显著缓解DSS诱导的结肠炎表型。IL-4和IL-13参与抗炎反应、伤口愈合和组织再生，在UC患者炎症黏膜中降低；IL-27亦对结肠炎和结肠炎相关癌症具有保护效应。API补充使这些降低的细胞因子水平正常化，并减少CXCL1和CXCL9，可能通过这些途径实现结肠保护。这些效应可能源于伞形科蔬菜中的植物化学物质，因为芹菜和欧防风并不能显著弥补TWD中特定的低微量营养素水平。芹菜和欧防风含有黄酮类（芹菜素、木犀草素）、酚酸（咖啡酸、对香豆酸）、聚乙炔类（镰叶醇、镰叶二醇）和呋喃香豆素（补骨脂素、佛手柑素、花椒毒素）等多类植物化学物质，这些化合物在动物和体外模型中显示出抗炎、细胞保护和抗氧化效应，为芹菜和欧防风的保护作用提供了生物学合理的途径。

肠道微生物多样性降低见于UC、CD和DSS处理的小鼠模型中。API补充改变了微生物群落结构并缓解DSS诱导的多样性丧失，提示其具有抗肠道微生态失调的保护作用。API最显著富集了Lachnospiraceae NK4A136组和Blautia，同时显著抑制了DSS处理诱导的最丰富菌属Paraclostridium。Blautia属干预可减少结肠炎症反应和氧化应激，增加盲肠SCFA产生，改善肠道屏障完整性并重塑微生物群落结构。Lachnospiraceae NK4A136是已知的丁酸产生菌，在多种结肠炎模型和CD中降低。Paraclostridium benzoelyticum是强效黏蛋白降解菌，而Paraclostridium bifermentans可加剧DSS诱导的小鼠结肠炎。因此，API介导的Paraclostridium减少及Lachnospiraceae和Blautia增加，提示其保护作用包括微生物群调节。

代谢组学方面，花生四烯酸是促炎性前列腺素和白三烯的主要来源，在IBD患者中升高。TWD消耗使粪便花生四烯酸在第12天增加，反映了该饮食中动物源性脂肪的高含量。丙烯醛是存在于多种食品中的有毒脂肪族醛，可由甘油三酯及多不饱和脂肪酸经脂质过氧化途径产生。TWD组粪便醛类的伴随增加和膳食PUFA的显著耗竭提示肠道氧化应激增加。API补充虽未能完全抵消这些变化，但确实缓解了TWD诱导的部分SCFA降低，并减轻了TWD诱导的胆酸、α-鼠胆酸、甲硫氨酰丝氨酸、丙酮和对羟基苯乙酸的增加，其中一些代谢物可能增加结肠炎症和癌症风险。

研究人员指出，每笼7-8只小鼠的饲养密度是本研究的局限性，因为共同饲养可导致笼具特异性微生物群变化，这可能贡献了第0天SCFA的基线变异。尽管实验单位在此类设计中常被视为笼具而非个体小鼠，但多个主要终点（包括组织学评分和炎症标志物）中保护趋势的一致性表明API补充的效应是稳健的。此外，有限的粪便体积妨碍了第17天的代谢组学分析，但第12天观察到的显著代谢变化提供了DSS处理前状态的重要信息。

研究结论为：将芹菜和欧防风补充至TWD中，可缓解DSS诱导的结肠炎，降低炎症标志物，并有利调节肠道微生物群和代谢组。API补充抑制了DSS诱导的致病细菌（主要是Paraclostridium）并促进了有益细菌（主要是Lachnospiraceae和Blautia）的生长。TWD消耗在DSS挑战前增加了粪便花生四烯酸和脂肪族醛类，提示这些TWD来源的粪便代谢物可能促进此前报道的TWD加剧的结肠炎和结直肠癌风险。API虽未能完全抵消这些特定变化，但确实缓解了TWD诱导的某些SCFA降低。API补充还减轻了TWD诱导的胆酸、α-鼠胆酸、甲硫氨酰丝氨酸、丙酮和对羟基苯乙酸的增加，其中一些可能增加结肠炎症和癌症风险。这些保护作用可能归因于伞形科蔬菜的纤维和植物化学成分，在人类等效摄入量约128 g/天的水平即可实现。然而，仍需进一步研究（包括与非伞形科蔬菜的直接比较）以充分阐明API保护结肠炎症及由此延伸的结直肠癌风险以及其他与西方型膳食模式相关慢性疾病的机制。