GLI1与GLI3的相互调控微调类风湿关节炎滑膜成纤维细胞致病行为的机制研究

《International Journal of Rheumatic Diseases》：Reciprocal Regulation of GLI1 and GLI3 Fine Tunes the Pathogenic Behavior of Synovial Fibroblasts in Rheumatoid Arthritis

　　

目的：探讨在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASF）中具有高表达的转录因子GLI3（GLI family zinc finger 3），尤其是其在THY1+CD34?亚衬里层亚群中，对RASF致病行为的调控作用。方法：采用Western blot定量新鲜分离RASF各亚群中GLI3蛋白水平；对总RASF进行GLI3或GLI1的小干扰RNA（siRNA）敲低（KD）后行转录组测序（RNA-seq）；使用GANT61（GLI抑制剂）处理RASF，通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/碘化丙锭（EdU/PI）分析、划痕实验、CCK-8法及Annexin V/PI流式细胞术分别检测RASF的增殖、细胞周期进程、迁移能力、活力及凋亡情况。结果：GLI3在THY1+CD34?RASF中于mRNA及蛋白水平均富集。GLI3敲低可上调GLI1及炎症、基质重塑和细胞周期相关基因（包括IL6、IL11、IL24、IL33、MMP3、PLAU、CCNA2和E2F1）的表达；通路富集分析显示细胞外基质–受体相互作用（ECM–receptor interaction）、PI3K–Akt及TNF信号通路激活。共敲低GLI1与GLI3可削弱单独敲低GLI3所诱导的IL11、IL24、IL33、CCNA2、E2F1及PLAU的上调，表明GLI1介导了GLI3缺失引起的一部分转录效应。GANT61抑制CCNA2和E2F1表达，抑制RASF增殖与迁移，且不显著诱导凋亡。结论：GLI3作为GLI1及其驱动RASF致病行为下游靶点的负调控因子发挥作用。靶向GLI1–GLI3轴可能是调节RA中成纤维细胞驱动的炎症及关节破坏的潜在治疗策略。

本文对发表于《International Journal of Rheumatic Diseases》的研究论文《Reciprocal Regulation of GLI1 and GLI3 Fine Tunes the Pathogenic Behavior of Synovial Fibroblasts in Rheumatoid Arthritis》进行解读与总结。

研究背景

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种以持续性滑膜炎症为特征的慢性自身免疫病，病理滑膜中免疫细胞和基质细胞——特别是滑膜成纤维细胞（Synovial Fibroblasts, SFs）——的相互作用驱动软骨退变与骨侵蚀。虽已有TNF-α（tumor necrosis factor alpha）、IL-6（interleukin-6）抑制剂及JAK–STAT通路小分子抑制剂等靶向治疗药物广泛应用，仍有约20%患者经多种生物或靶向合成改善病情抗风湿药（biologic or targeted synthetic disease-modifying antirheumatic drugs, b/tsDMARDs）治疗后应答不足或不能耐受，即难治性RA（difficult-to-treat RA, D2T RA）。滑膜活检转录组指导的R4RA试验提示，富含成纤维细胞相关基因特征的滑膜组织对传统免疫抑制疗法反应较差，提示直接靶向致病性类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASF）可能补充现有免疫调节手段。RASF具有类肿瘤特性，如不受控增殖、高迁移侵袭潜能、促血管生成及分泌炎性介质，但目前尚无批准药物特异性靶向RASF。前期微阵列转录组分析发现，THY1⁺CD34^?亚衬里层RASF亚群高表达转录因子GLI3（GLI family zinc finger 3），该亚群与侵袭性成纤维细胞表型密切相关；而Hedgehog（HH）–GLI信号通路中GLI1通常作为转录激活子促进RA病理，GLI3则可加工为全长激活型（GLI3-FL, full-length GLI3）或截短抑制型（GLI3-R, repressor form of GLI3），既往在RASF中功能不明。因此，明确GLI3在RASF致病行为中的功能及GLI1–GLI3互调关系具有重要理论与转化意义。

主要关键技术方法概述

研究人员自接受关节成形术的RA患者获取滑膜组织（经医学研究伦理委员会批准及受试者书面知情同意），经酶解后分两路处理：①新鲜分离活体CD45^?CD235a^?CD31^?PDPN⁺细胞，流式分选为THY1^?CD34^?、THY1⁺CD34^?及THY1⁺CD34⁺RASF亚群，用于Western blot检测GLI3-FL（190 kDa）与GLI3-R（83 kDa）蛋白；②原代培养传至6–10代的总RASF，进行siRNA介导的GLI3、GLI1单独及联合敲低（KD），TNF-α刺激后提取poly(A)⁺RNA行链特异性mRNA测序（RNA-seq）并用DESeq2分析差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），以假发现率（False Discovery Rate, FDR）≤0.05为显著；并行qPCR验证。功能实验采用GLI抑制剂GANT61预处理，通过划痕实验评估迁移，EdU/PI流式细胞术检测DNA合成与细胞周期时相分布，CCK-8法测细胞活力，Annexin V/PI双染流式细胞术检测凋亡。数据统计采用配对t检验或单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Bonferroni多重比较检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

研究结果

3.1 GLI3 Is Preferentially Expressed in the THY1⁺CD34^?RASF Subset（GLI3选择性表达于THY1⁺CD34^?RASF亚群）

重新分析既往微阵列与公共单细胞RNA-seq数据发现GLI3 mRNA在THY1⁺CD34^?亚群显著上调，而其他HH–GLI通路组分（SHH、SMO、SUFU、PTCH1、GLI1、GLI2）在各亚群间无显著差异。Western blot显示GLI3-FL与GLI3-R蛋白在THY1⁺CD34^?亚群均高于另两亚群，且GLI3-R为各亚群主要存在形式。结论：GLI3在致病性THY1⁺CD34^?RASF亚群于mRNA及蛋白（FL与R型）水平均高表达，其上调可能不依赖经典HH配体激活。

3.2 GLI3 Represses Pro-Inflammatory and Proliferative Gene Programs in RASFs（GLI3抑制RASF中促炎与促增殖基因程序）

对siGLI3转染后经TNF-α刺激的RASF行RNA-seq，GLI3敲低显著上调GLI1及IL6、IL11、IL24、IL33、MMP3、PLAU、CCNA2、E2F1等RASF致病相关基因；KEGG富集分析示上调基因显著富集于ECM–受体相互作用、PI3K–Akt、黏着斑（focal adhesion）、TNF信号及细胞因子–细胞因子受体相互作用通路。独立样本qPCR验证上述趋势。结论：GLI3在RASF中主要发挥转录抑制作用，抑制炎症、增殖与迁移相关基因表达及上述致病通路。

3.3 GLI1 Mediates a Subset of Gene Induction Following GLI3 Knockdown（GLI3敲低后部分基因诱导由GLI1介导）

单独敲低低基线表达的GLI1对基因表达影响微弱；共敲低GLI1与GLI3可显著削弱单独敲低GLI3引起的IL11、IL24、IL33、CCNA2、E2F1及PLAU上调，而IL6与MMP3的上调不被GLI1共敲低影响。结论：GLI1作为GLI3所抑制基因中部分的转录激活子，GLI3–GLI1轴选择性调控RASF中炎症与增殖基因，IL6和MMP3受GLI1非依赖机制调控。

3.4 Pharmacological Inhibition of GLI1 Suppresses RASF Proliferation and Migration（GLI1药理抑制抑制RASF增殖与迁移）

GLI1抑制剂GANT61剂量依赖性地抑制RASF划痕愈合（迁移）、EdU掺入率及S期细胞比例，下调CCNA2与E2F1 mRNA表达，5 μM GANT61不明显降低细胞活力（CCK-8），Annexin V/PI检测未见总凋亡率显著升高。结论：生理条件下被GLI3抑制的GLI1促进RASF增殖与迁移表型；GLI1特异性抑制可在不引起明显凋亡及非特异性毒性下抑制RASF致病性功能。

讨论与结论总结

讨论指出，本研究首次在RASF中证实GLI3是GLI1的负调控因子，GLI3高表达于THY1⁺CD34^?致病亚群并通过竞争结合GLI位点或维持GLI3-R水平抑制GLI1活性，从而限制GLI1靶基因（如CCNA2、E2F1、PLAU、部分IL家族成员）转录，防止RASF过度活化。GLI3在RASF中主要行使经典抑制功能，其上调机制可能与Wnt/β-catenin、Notch或TLR4–TRIF–IRF3等非经典HH通路有关，但具体机制未明。GANT61在临床前模型中可减轻胶原诱导性关节炎（CIA）严重程度，本研究体外结果与之相符且提示GLI1抑制主要阻断增殖与迁移而非诱导死亡。研究局限性包括GLI3上调精确机制未阐明、RA患者样本量偏小、原代总RASF培养可能掩盖亚群特异效应、未直接施加HH配体刺激。未来需结合单细胞解析及配体扰动实验深化认识。

结论译文：研究人员确定GLI3是类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASF）中GLI1的负调控因子。GLI家族转录因子活性失调促使炎性介质过度产生及RASF异常增殖与迁移。这些发现凸显GLI1–GLI3相互调控轴作为一种新型RA发病机制及一个有前景的治疗靶点的重要意义。