电压门控钾通道 KV7.1 激活配体的构效关系研究

《Archiv der Pharmazie-Chemistry in Life Sciences》：Structure–Activity Relationship Study on Ligands Activating the Voltage-Gated Potassium Channel KV7.1

　　

KV7.1激动剂有望用于治疗高血压、心律失常及早产。已有报道指出3-(吲哚-3-基甲基)取代的1,4-苯二氮?(R)-L3是一种强效KV7.1激活剂。本研究以(R)-L3为先导化合物，系统地在8个位置（包括3位构型）对其进行结构修饰。研究人员通过Sugasawa反应以BCl3和AlCl3为催化剂，由苯胺2、3与各种取代苯甲腈区域选择性地制得所需2-氨基二苯甲酮4；随后使4与氨基酸衍生的1,3-噁唑烷-2,5-二酮7或11反应合成目标1,4-苯二氮?8和12。二级内酰胺8和12去质子化及烷基化过程中未观察到消旋，但二级内酰胺8b转化为硫代内酰胺17时发生消旋，外消旋体rac-17及三唑rac-18经手性高效液相色谱(chiral HPLC)拆分了对映异构体。研究人员采用两点电压钳(two-electrode voltage-clamp, TEVC)评价所得1,4-苯二氮?对离子通道的调节作用，结果表明(3R)-构型及3位吲哚基甲基(indolylmethyl)片段是激活KV7.1所必需的；二级内酰胺8b和甲基化内酰胺9b表现出高活性，但更大的N-取代基会降低通道激活能力；硫代内酰胺(R)-17和三唑(R)-18未能显著激活KV7.1通道；将5位苯环2位氟原子替换为氢或其他卤素原子会降低KV7.1活性；而9位羟基衍生物9i较(R)-L3（即9b，1 μM时+45%）表现出更高激动活性（1 μM时+68%）。此外，酚类化合物9i显示出更高的Ⅰ相代谢稳定性。

《Structure–Activity Relationship Study on Ligands Activating the Voltage-Gated Potassium Channel K_V7.1》论文解读

研究背景与立题依据

电压门控钾通道K_V7.1（由KCNQ1基因编码，亦称K_VLQT1）广泛分布于人体心脏、子宫平滑肌、胰腺及内耳等组织。在心肌细胞中，K_V7.1同源四聚体与辅助亚基KCNE1（minK）组装形成慢延迟整流钾电流（I_Ks），调控动作电位时程；其功能缺失突变可导致长QT综合征1型（LQTS1）及致死性心律失常。此外，K_V7.1激活可引起细胞膜超极化，减少电压依赖性Ca²⁺通道开放，从而舒张血管平滑肌（降血压潜力）及抑制子宫平滑肌收缩（抗早产潜力）；KCNQ1多态性与2型糖尿病相关，提示其对胰岛素分泌的调节作用。因此，K_V7.1激活剂在心血管疾病、高血压、早产防治及代谢性疾病方面具重要药理价值。已知先导化合物(R)-L3（即(R)-3-[(1H-吲哚-3-基)甲基]-5-(2-氟苯基)-1-甲基-1,3-二氢-1,4-苯二氮?-2-酮，9b）可激活K_V7.1并缩短豚鼠心肌细胞动作电位时程，但关于其骨架各位置结构修饰对K_V7.1激活活性的详细构效关系（Structure–Activity Relationship, SAR）尚未见系统报道。本文由研究人员系统合成31个(R)-L3衍生物并评价生物活性，阐明K_V7.1结合口袋的结构要求。

主要关键技术方法

研究人员采用Sugasawa反应（BCl₃/AlCl₃催化苯胺与苯甲腈）区域选择性合成2-氨基二苯甲酮中间体；以氨基酸Boc保护-(R)-色氨酸或(R)-苯丙氨酸与PCl₃原位生成1,3-噁唑烷-2,5-二酮（oxazolidinedione），再与2-氨基二苯甲酮缩合环化制备3-取代-1,4-苯二氮?-2-酮（1,4-benzodiazepin-2-one），避免C-3位消旋；用NaH/卤代烷进行N-1烷基化，用BBr₃脱甲基得9-酚羟基衍生物，用Lawesson试剂将内酰胺转为硫代内酰胺，再与乙酰肼环合为[1,2,4]三唑并[4,3-a]苯二氮?；通过手性HPLC（Daicel Chiralpak IA/AD柱）验证产物对映体过量（ee＞99.9%）及拆分消旋硫代内酰胺与三唑；采用非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus laevis oocytes）显微注射KCNQ1 cRNA表达K_V7.1通道，以两点电压钳（TEVC）记录?120 mV尾电流变化评估化合物（10 μM，部分做浓度梯度）对通道活性的影响（以仅含缓冲液为对照）；测定选定化合物的logD_7.4（微摇瓶法）、人血清白蛋白固定相高效亲和色谱（HPAC）测血浆蛋白结合率（PPB）及小鼠肝微粒体+NADPH孵育90 min后剩余母体百分比评估Ⅰ相代谢稳定性。

研究结果

2.1 合成（Synthesis）

研究人员使用Sugasawa反应成功区域选择性制得系列2-氨基二苯甲酮4a–h（含不同卤素/吡啶/邻甲氧基苯基取代）。以Boc-(R)-色氨酸与PCl₃生成的噁唑烷二酮与4a–h缩合得二级内酰胺8a–h，经NaH/CH₃I甲基化得三级内酰胺9b等；相同路线以Boc-(R)-苯丙氨酸制得苄基取代苯二氮?12a,b及甲基化产物13a；BBr₃脱甲基得9-OH衍生物8i、9i；NaH与不同烷基硼酸盐烷基化得N-乙基14、N-丁基15、N-2,2,2-三氟乙基16；Lawesson试剂将8b转为硫代内酰胺rac-17（伴随C-3消旋），再与乙酰肼环合为三唑rac-18；手性HPLC拆分得对映体(R)-17、(S)-17及(R)-18、(S)-18。手性HPLC证实8、9系列合成过程无消旋（ee ≥ 99.9%），而硫代及三唑环化导致消旋。

2.2 对映体纯度评价及17与18对映体拆分（Evaluation of Enantiopurity of 9b and Separation of Enantiomers of 17 and 18）

研究人员制备了9b与其对映体ent-9b的外消旋混合物并进行手性HPLC分析，测得9bee = 99.9%，ent-9bee = 100.0%，确认合成路线未引起消旋。rac-17与rac-18经半制备手性HPLC拆分得到单一对映体，ee均＞99.9%。根据保留时间比对及比旋光度符号（(R)-构型为右旋，(S)-构型为左旋）完成绝对构型归属。

2.3 TEVC检测1,4-苯二氮?对K_V7.1通道的活性（Activity of 1,4-Benzodiazepines at the K_V7.1 Channel Measured by TEVC）

C-3位必须为(3R)-构型才能激活K_V7.1：(R)-构型8b（+85±14%）、9b（+84±14%）具强激活作用，而其(S)-对映体ent-8b（?13±4%）、ent-9b（?17±11%）无激动活性甚至略呈抑制。

3位侧链吲哚基甲基不可替代：将吲哚-3-基甲基换为苄基（12b，?16%；13a，?11%）完全丧失激活能力。

N-1取代基大小敏感：H（二级内酰胺8b，+85%）与CH₃（9b，+84%）均可，活性顺序为甲基（9b，+84%）＞乙基（14，+24%）＞三氟乙基（16，?18%）＞丁基（15，?21%），较大烷基产生抑制。

5位苯环2-位需吸电子取代基：F（8b，+85%）＞Cl（8c，+39%）＞Br（8d，+11%）＞I（8e，?3%）；无2-位取代（8a，+6%）活性极弱；插入CH₂间隔基（8f，?29%）转为抑制。

内酰胺氧的生物等排替换降低活性：硫代内酰胺(R)-17（+13%）、三唑(R)-18（+24%）较8b（+85%）活性显著下降。

9位修饰：9-OCH₃（8h，?6%；9h，+6%）无活性；9-OH二级内酰胺8i（+66%）与甲基化9i（+92% @10 μM；+68% @1 μM）活性等于或高于先导物9b（+84% @10 μM；+45% @1 μM）；(R)-18在1 μM仅+9%。

浓度—效应结果显示8b、9b、9i在100 nM无显著激活，1 μM与10 μM呈浓度依赖性激活。

2.4 选定配体的理化性质与药代动力学参数（Physicochemical and Pharmacokinetic Properties of Selected Ligands）

研究人员测得8b、9b、9i、(R)-18的logD_7.4分别为3.99、4.08、4.16、3.31，均符合Lipinski五规则（logD＜5）。所有化合物与人血清白蛋白结合率＞98%。小鼠肝微粒体温孵90 min后剩余母体比例：(R)-18（82%，最高）＞9i（73%）＞9b（62%）＞8b（59%）；9位引入酚羟基（9i）较先导物9b提高了Ⅰ相代谢稳定性。

讨论与结论（Conclusion）翻译

研究人员曾报道3-[(吲哚-3-基)甲基]?1,4-苯二氮?(R)-L3（9b）是K_V7.1的强效激活剂，但结构修饰与K_V7.1激活间的构效关系未见报道。本研究设计系列3-芳基甲基取代1,4-苯二氮?，制备31个衍生物并进行药理评价。通过TEVC实验记录合成1,4-苯二氮?对K_V7.1通道活性的影响，全面揭示了K_V7.1调节的结构要求。

C-3位(3R)-构型被证实为K_V7.1激活的关键： (R)-构型1,4-苯二氮?8b与9b显著增大离子电流，而(S)-构型对映体ent-8b与ent-9b完全丧失激动活性。

除C-3构型外，对先导物9b的1,4-苯二氮?骨架在七个位点进行修饰：5位苯环2位氟原子替换为氢或其他卤素原子导致活性降低；N-1为H或小的CH₃可被K_V7.1通道结合口袋耐受，但更长烷基链、硫代内酰胺或将内酰胺嵌入三唑环则显著降低激动活性；吲哚-3-基片段对K_V7.1激活不可或缺——替换为苯基只产生微弱抑制。

出乎意料的是，9位带OH基团的酚衍生物9i在K_V7.1通道上较先导物9b显示更高激动活性。尽管其亲脂性略有增加（logD_7.4＝4.16），其代谢稳定性亦提高——与小鼠肝微粒体及NADPH孵育90 min后有73% 9i保持原形，而9b仅存62%。