综述：从微组织到宏观解决方案——可扩展和自动化软骨组织工程的未来

《Journal of Orthopaedics》：From microtissues to macro solutions – The future of scalable and automated cartilage tissue engineering

　　

关节软骨损伤对社会造成的负担持续增加。需要合适的治疗方法来减轻疼痛、改善生活质量，并避免进展为骨关节炎（OA）。目前的再生软骨修复策略在临床实践中仍受到高成本、复杂的物流、患者负担以及报销不足的限制。为了确保治疗创新能有效惠及患者，开发过程中的重点应放在自动化和可扩展的解决方案上。一个有前景的概念是使用软骨微组织作为构建模块，采用模块化方法创建更大的软骨构建物。通过实现可控的微组织组装和可重复、可扩展的制造，这可能导致组织工程软骨植入物的高效生产。已有文献描述了多个自动化和可扩展的步骤，从细胞分离和扩增到微组织形成和收获，最终到宏观组织组装和成熟。然而，将所有步骤整合到一个单一、成本效益高且自动化的过程中仍然是一个概念性的想法。本综述重点关注未来即用型组织工程软骨植入物早期设计过程中应考虑的潜在路径和关键选择。此外，还讨论了研究和实施自动质量测量与清洁方案的附加价值，以及推荐的监管检查和成本效益影响。本文的转化潜力：以可扩展、自动化和符合GMP（良好生产规范）的方式利用微组织进行软骨组织工程，可以应对日益增长的关节软骨损伤负担。本综述通过关注在软骨组织工程解决方案设计过程中早期实施这些概念，确保其在当前医疗保健系统中的兼容性和可行性，展示了该方法的转化潜力。

**1. 引言**
**1.1. 软骨缺损及当前治疗方案**
关节（如膝关节）中的关节软骨缺损很常见，在关节镜检查中，60-66%的膝关节可观察到缺损。关节软骨无血管、无神经，且组织中软骨细胞数量少，导致其再生能力有限。充分治疗软骨缺损对于减轻疼痛、恢复功能、改善生活质量以及避免关节损伤进展为骨关节炎（OA）并最终需要全膝关节假体至关重要。治疗软骨损伤的常见方法包括在软骨缺损下方的软骨下骨中制造微骨折，使干细胞从骨髓迁移至缺损处。然而，纤维软骨的形成仍是一个问题，因其力学性能低于天然透明软骨，会随时间降解。另一种方法是骨软骨自体移植转移术（OATS），即从膝关节非负重区获取骨软骨移植物并植入缺损处。缺点包括供区病变以及与周围软骨整合不良。为避免供区病变，同种异体移植物也被成功用于治疗较大缺损，但此方法仍受到新鲜供体材料可用性低和高成本的限制。目前临床上唯一的软骨缺损再生细胞疗法是自体软骨细胞植入术（ACI）。ACI是一个两步过程，先获取自体软骨细胞并扩增，然后用于修复缺损。将扩增的关节软骨细胞（ACs）植入软骨缺损处，并用骨膜瓣（第一代ACI）或胶原膜（第二代ACI）覆盖，已被证明可促进软骨修复。然而，在这些方法中，由于扩增过程中ACs的去分化，会产生纤维软骨和透明软骨的混合物。为了逆转去分化，引入了基质辅助软骨细胞植入术（MACI）（第三代ACI），即将ACs接种到胶原支架上，并将整个构建物作为一个整体植入。基于微组织的ACI（第三/第四代ACI）也已用于临床，并显示出良好的结果和透明样软骨再生，可用于面积达10 cm2的缺损。这种方法依赖于完全自体的细胞产物，不需要额外的细胞载体、膜或缝合线，因为微组织直接粘附于软骨下骨。然而，手术后不允许立即负重，因为微组织成熟并整合到宿主软骨和软骨下基质中需要几个月到几年的时间。因此，患者面临较长的康复期和延迟恢复全部活动。尽管ACI已在临床试验中进行了30多年，美国食品药品监督管理局（FDA）早在1997年就批准了第一种ACI，欧洲药品管理局（EMA）于2009年批准，但由于患者负担、复杂的物流、高昂的相关成本以及许多国家报销不足甚至没有报销，其在临床实践中的应用仍然有限。
**1.2. 基于微组织的软骨组织工程用于自动化和可扩展的软骨植入物开发**
再生医学和组织工程在增强软骨修复和开发即用型治疗产品方面前景广阔。鉴于社会OA负担日益增加，确保这些创新能有效惠及患者至关重要。为此，应致力于开发可扩展和自动化的方法，使此类疗法从医疗保健提供者和支付者的角度来看既可行又有吸引力。在此背景下，“自动化”指的是使用可编程的封闭或半封闭系统，能够在最少人工干预下执行工艺步骤。而“可扩展”指的是采用技术来增加体积化或并行化的生产通量，从而每批次生产出更多的微组织。在大多数情况下，需要通过生物反应器和机器人实现一定程度的自动化，以达到或增强可扩展性。软骨微组织是由细胞和含有组织特异性特性的软骨基质组成的三维（3D）结构，可作为模块化方法中的构建模块，创建具有高细胞密度的大型软骨构建物。与传统的单细胞培养技术相比，微组织包含细胞-基质和细胞-细胞相互作用，这有助于软骨形成。因此，微组织越来越多地被用于高效组织工程。除了支持快速、可控地创建大型软骨构建物外，微组织也非常适合融入新型自动化和可扩展的制造技术中。然而，迄今为止，没有一个完全整合的软骨组织工程平台能自动化从细胞分离和增殖，到微组织形成、分化、潜在的预组装和构建物成熟，最后到质量控制的所有阶段。一个符合此概念的、用于骨软骨组织工程的概念性自动封闭系统名为JointPromise，已有描述。其他研究仅以自动化、可扩展或符合良好生产规范（GMP）的方式描述了过程的某些部分，GMP指的是确保产品质量一致并根据监管质量标准进行控制的制造过程。在软骨组织工程中，已有多种细胞来源被研究并在临床使用。然而，并非所有细胞都适用于高通量和规模化制造方法。同样的挑战也适用于创建微组织并将其组装成更大构建物的不同方法，包括所需的自动监测和质量控制。在此，我们回顾、强调并提出了在基于微组织的模块化大规模软骨组织工程设计过程中早期应考虑的潜在路径和选择，以实现自动化、符合GMP且成本效益高的过程，并满足监管标准。
**2. 规模化与自动化的软骨组织工程细胞生产**
软骨组织工程的创新依赖于对合适细胞来源的谨慎选择。尽管多年来已研究了许多细胞来源，但并非所有都适用于大规模、自动化和符合GMP的制造过程。第2.1节探讨了软骨组织工程中主要细胞来源的特征、优势和挑战。在此基础上，第2.2节讨论了这些细胞来源在可扩展和自动化生产过程中的应用。
**2.1. 软骨修复的细胞来源**
在软骨组织工程中，已探索了多种细胞来源，每种都有其独特的优势和劣势。同种异体细胞本质上更具可扩展性，因为它们能够从最佳供体中生产大量细胞，创建即用型产品并允许单阶段手术。然而，其转化成功在很大程度上取决于其在修复关节软骨方面的安全性和有效性。另一方面，自体细胞如关节软骨细胞（ACs）已在过去几十年中用于临床并显示出有希望的结果。由于是患者来源的细胞，免疫排斥风险极低。然而，自体ACs仍受限于两步手术、可扩展性降低和成本较高。除了金标准的自体ACs，从患者鼻中隔组织获取的软骨细胞（鼻软骨细胞，NCs）也被探索用于治疗膝关节软骨缺损。其获取微创，供区病变低，且不会给患者带来任何相关不适。体外研究表明，扩增后的NCs显示出比ACs更优越且更可重复的软骨形成能力。首次人体研究证明了体外成熟的NCs基组织工程软骨治疗局灶性缺损（2-8 cm2）的安全性和有效性。这些发现进一步支持了工程化成熟组织用于软骨修复的临床相关性。这些工程化组织的长期稳定性需要进一步评估。间充质基质细胞（MSCs）是多能细胞，可向软骨形成谱系分化。它们可在体外扩增，其旁分泌因子刺激组织再生，并具有抗炎特性，有助于减轻关节炎症并促进OA条件下的组织修复。MSCs可从多个部位获取，最常见的是骨髓，但其采集相对侵入性。其他来源，如羊水、脂肪组织、脐带血和月经血，已引起关注并在软骨修复中显示出有希望的结果。对于软骨修复，自体及同种异体MSCs均已被使用。使用MSCs进行软骨修复的缺点包括形成纤维软骨以及软骨形成诱导的MSCs频繁发生肥大分化，形成矿化组织。然而，同种异体MSCs的软骨诱导特性已在人体临床试验中得到充分证明，供体MSCs与回收的自体软骨细胞结合，增强了局灶性缺损中的软骨再生。存在于软骨表层的关节软骨祖细胞（ACPCs）是软骨工程中一个有吸引力的细胞来源，先前的研究在体外和体内均显示出有希望的软骨修复结果。ACPCs具有广泛的增殖能力，同时能够产生质量上更好的透明样软骨基质，富含II型胶原和糖胺聚糖（GAGs），优于骨髓或脂肪来源的MSCs（ADSCs）。此外，它们在扩增过程中能保持软骨形成潜能长达30次群体倍增，并且不会发生肥大分化，从而克服了软骨工程中的主要挑战。与使用自体ACs类似，使用自体ACPCs仍需要漫长的两步手术，ACPCs（甚至比ACs更少）需要从患者体内获取并广泛扩增以达足够数量的细胞，使得规模化面临挑战。同种异体ACPCs以符合GMP的方式扩增已得到证实，其用于软骨修复已在大型动物模型中进行了研究。然而，负载同种异体ACPCs的构建物在体内显示出不同的修复结果，既无肥大分化迹象，也无令人满意的关节软骨组织再生。总体而言，为克服使用自体细胞的缺点，即用型细胞来源可提供可行且可扩展的解决方案。因此，人们对使用同种异体多能干细胞越来越感兴趣。例如，胚胎干细胞（ESCs）可以无限扩增，创造出可持续的细胞来源，同时它们在刺激下也显示出良好的软骨形成特性。然而，风险包括致瘤性以及对软骨形成分化过程了解不足，使得临床应用困难。另一个有前景的即用型细胞来源是诱导多能干细胞（iPSC），它可以向软骨细胞分化并用于软骨再生。体外研究已显示出令人鼓舞的结果，利用iPSCs生产了软骨样微组织。此外，体内动物研究表明，将iPSC衍生的软骨构建物成功植入免疫缺陷大鼠和猴子的软骨缺损中，形成了良好的透明软骨修复组织。迄今为止，已有多种分化方案描述将iPSCs分化为诱导软骨细胞（iCHOs），这些细胞经历各种中间细胞类型，如诱导间充质基质细胞（iMSCs）、可扩增肢芽间充质（ExpLBM）细胞和诱导软骨祖细胞（iCPCs）。证明这些方案的临床有效性和安全性并达成标准化方法的一致意见至关重要。最后，使用iPSC系的一个关键挑战是其基因组不稳定性，这可能发生在任何处理阶段。
**2.2. 自动化、符合GMP且可扩展的细胞扩增**
已有文献报道或商业上实施了多种大规模、自动化且符合GMP的细胞扩增策略，特别是在细胞治疗和再生医学领域。此类策略或概念可用于获取足够数量的细胞用于大规模软骨微组织生产。培养系统的选择受细胞类型和来源及其在特定条件下生长特性的强烈影响。通常，用于软骨修复的细胞来源（如第2.1节所述）是贴壁的。然而，悬浮培养本质上比自动化贴壁静态培养更具可扩展性，后者受限于表面积。因此，对于软骨工程方法，悬浮培养需要连续搅拌以实现聚集形成（如果细胞类型允许），或添加基质或微载体组分以支持细胞粘附。与此一致，多项研究探索了搅拌悬浮培养用于扩增用于软骨修复的不同细胞类型，包括ACs、MSCs和iPSCs。ACs在单层扩增时倾向于去分化，并且在悬浮培养中也不能作为单细胞生长。为了在保持软骨形成表型的同时实现ACs的可扩展扩增，在悬浮培养的3D结构中或上生长细胞提供了一种解决方案。例如，在悬浮培养中扩增3D聚集体的ACs导致了高群体倍增，细胞产生软骨样基质。为了进一步促进微组织中ACs的扩增，添加了促进聚集和增殖的刺激因子，例如猪脊索细胞来源的基质。然而，这种具有异种来源和成分变异性的添加剂面临监管挑战且临床适用性受限。最后，除了增强可扩展性外，搅拌悬浮培养还提供了诸如降低成本、减少对耗材的依赖以及加快培养时间等优势。例如，研究表明，使用0.5L搅拌悬浮培养进行iPSC聚集体扩增，与贴壁2D培养的19倍增长相比，可实现100倍增长，成本降低近6倍。另一种方法是在这些动态生物反应器系统中添加微载体，贴壁细胞可附着并扩增，同时保持软骨形成特性。作为这些系统可实现的可扩展性增强的示例，使用含有明胶甲基丙烯酰（GelMA）微载体的旋转生物反应器已被证明在短短八天内即可实现贴壁细胞的16倍扩增，且微载体可快速溶解，简化了细胞收获。作为下一步，最近描述了一种封闭式自动化生物反应器，结合了可溶性微载体，可在可扩展的扩增袋中进行细胞扩增并自动更换培养基。此类系统的优点包括减少了人为操作和错误，因此降低了污染风险并实现了可控的细胞扩增。虽然悬浮培养提供了更大的可扩展性，但自动化和封闭的贴壁静态技术也得到了广泛研究和商业化。制造商已引入了几种技术并用于大规模生产临床级MSCs，例如CliniMACS Prodigy?（美天旎）、Cocoon?平台（龙沙）和Quantum?细胞扩增系统（泰尔茂比司特）。所有这些系统都能够在封闭和受控条件下自动进行细胞扩增、培养基更新和收获。对于iPSC生产和扩增，还引入了一种称为"StemCellFactory"的系统。该系统自动化了整个过程，从成纤维细胞扩增和重编程为iPSC，到随后在贴壁孔板中扩增。除了生产和扩增，细胞分化也可以在孔板中自动化，如AutoCRAT系统所示。尽管取得了这些进展，此类平台仍然非常复杂，并依赖昂贵的耗材，使其整体上成为成本高昂的制造选择，特别是对于通常以小批量生产的自体细胞。除了细胞类型的生长需求外，在设计用于自动化细胞生产的培养系统时，还应考虑细胞来源。例如，自体细胞的使用会引入质量和数量上的变异性，从而需要不仅能够从患者组织中分离细胞并扩增，而且能够动态适应广泛细胞行为的自动化平台。已经提出了一种用于从软骨活检中自动且符合GMP地分离ACs并进行后续贴壁细胞培养的系统。该系统通过使用机器人手臂切碎软骨并分离、接种和培养细胞，并自动更换培养基和清洁，侧重于降低污染风险并产生可靠、一致的工程化软骨组织产品。
**3. 使用微组织进行可扩展的软骨组织工程**
在细胞扩增和收获之后，单细胞必须过渡到促进细胞-细胞相互作用并支持微组织形成的3D微环境。该过程由细胞间粘附分子（如N-钙粘蛋白）以及细胞骨架整合素和蛋白启动，驱动细胞-细胞粘附、聚集和早期压实。一旦建立细胞间粘附，细胞开始产生细胞外基质（ECM），通过锚定蛋白（如整合素）与细胞骨架结合。细胞与ECM纤维的这种相互作用进一步促进了结构组织，并提供了指导早期表型成熟的力学和生化信号。随着时间的推移，增加的细胞粘附和基质沉积导致形成致密、球形且力学稳定的微组织。接下来进入基于微组织的软骨植入物生产工作流程中的下一步，第3.1节关注微组织作为软骨工程中的构建模块，第3.2节讨论其在不同3D环境中的自动化及可扩展生产。
**3.1. 微组织作为软骨工程的构建模块**
从单细胞工程化软骨移植物以修复大面积缺损是具有挑战性的，因为它需要高细胞数量，通常导致扩散限制，从而产生营养和生长因子梯度，影响存活率和所得组织的表型均一性。这激发了人们越来越有兴趣使用微组织作为构建模块单元来工程化预定义形状的大规模软骨植入物，这些微组织通常在受控条件下工程化，且特性低于扩散限制阈值。微组织通常被称为球体、细胞聚集体或类器官。尽管这些术语在文献中互换使用，但关于它们的定义尚无明确共识，且软骨工程领域中现有的定义既不特异又相互重叠。因此，我们在本综述中采用术语软骨微组织以保持一致性。然而，它们先前已被定义如下：聚集体是细胞簇；球体是球形、致密的具有特定表型的细胞簇；类器官由自组织成更复杂、具有自主生物学功能的组织样结构的细胞形成。软骨微组织通常通过非粘附环境（如微孔、悬滴系统或搅拌生物反应器）中的自组装形成。该过程类似于胚胎发育，细胞在没有外部影响的情况下聚集。此外，与2D单层或单细胞悬浮液相比，微组织的3D结构提供了一个促进细胞类天然空间分布的环境。这样的环境支持增强的细胞-细胞和细胞-基质相互作用、蛋白质分泌、ECM沉积、稳定形态、极化和生理代谢功能。例如，在微组织中成熟MSCs克服了软骨形成分化过程中单个MSCs常见的挑战，如矿化和受限的营养扩散。虽然与天然软骨相比，微组织通常表现出高细胞数量，但微组织中的细胞能够产生大量的软骨样基质。大量研究表明，微组织可以成功组装并融合成毫米级甚至厘米级的构建物用于软骨和骨修复。它们的使用导致了受控且改善的新生组织形状保真度。微组织融合通常通过差异粘附假说（DAH）来解释，该假说认为微组织的类液体行为使它们能够通过N-钙粘蛋白介导的连接相互粘附并逐渐合并成更大的结构。融合效率还受到细胞骨架动力学的影响，因为活跃细胞中细胞骨架组织的频繁变化增加了组织流动性并改善了融合。此外，细胞类型和培养条件等生物学因素也会影响融合行为。最近体外研究表明，AC微组织仅在补充有转化生长因子-β（TGF-β）和/或L-抗坏血酸的培养基中融合，而MSC微组织的融合能力似乎在很大程度上独立于生长因子刺激方案。基于微组织的植入物开发中一个常见的挑战是微组织融合后重塑不足，导致持续的球体结构和不完全重塑成统一组织。已经研究了几种解决方案，可以组合使用来改善这一挑战。例如，使用更多数量的小微组织已被证明能形成具有均匀基质分布的更透明样软骨结构。较小且球形的微组织已知具有更高的刚度并融合得更快。在较小的微组织中，分子可以更好地扩散，导致整个微组织中的氧张力更均匀，这有利于在低氧培养条件下进行更受控的软骨形成分化。此外，球形几何形状在填充彼此间的空隙方面更优。最后，除了尺寸外，微组织的成熟状态也影响其融合能力和重塑潜力，通常成熟度较低的球体表现出更优的融合。除微组织相关参数外，生物材料特性在调节融合和融合后重塑方面也起着关键作用。在水凝胶存在下，融合现象取决于球体间距离和细胞迁移潜力，两者都很大程度上受水凝胶特性（如粘弹性和降解速率）的影响。快速降解的水凝胶允许动态基质重塑，增强整个构建物中的营养和氧气扩散，从而支持更均匀的组织成熟。同样，具有快速应力松弛行为的低刚度水凝胶促进细胞从单个微组织迁移出来，并促进它们重组为统一组织。对于软骨微组织，更具粘性的环境已被证明能促进ECM沉积。然而，在软骨组织工程中，必须仔细平衡水凝胶的力学特性以支持软骨形成分化。过刚的水凝胶会导致应力屏蔽并促进成纤维细胞表型，而过软的水凝胶可能在某些细胞类型（如MSCs）中诱导不希望的成脂分化。有趣的是，最近研究表明，微调微组织生物打印平台中支撑水凝胶浴的力学特性，能够精确控制施加于微组织的物理约束，从而调节其表型、融合和ECM组织。特别地，增加浴刚度被证明能增强胶原纤维排列。其他提供结构支撑的生物材料，包括可生物降解的聚合物支架，也可通过其结构、孔径和降解行为影响微组织融合。例如，侧面有孔的聚己内酯（PCL）桶形微纤维支架增加了孔隙互连性，从而促进微组织互连和融合。
**3.2. 微组织生产**
除了第2.2节中描述的细胞自动化和可扩展扩增外，微组织形成和培养的自动化对于实现成本效益高的组织生产过程也具有重要意义。搅拌瓶和其他基于搅拌的生物反应器能够在动态环境中实现大规模球形微组织生产，该环境促进营养和氧气输送以及代谢废物清除。此类系统已被广泛用于从各种细胞来源生成软骨形成微组织，并促进去分化软骨细胞的再分化。为了增强可扩展性，在搅拌瓶中成功生产了软骨样微组织，使用了原代牛和人ACs与基质添加剂，或人ACPCs与骨形态发生蛋白9（BMP-9）。此外，搅拌瓶也用于在六周内从iPSCs高效地产生大量软骨样微组织。尽管这些方法不是自动化的，并且缺乏对温度和氧气等因素的控制，但培养基更换快速简便，并且有可能将其转化为现有概念的自动化搅拌生物反应器。这种方法的一个缺点是产生的微组织尺寸范围宽。然而，可以通过过滤来获得更均匀的尺寸范围；但这一过程不可避免地会导致一些微组织的损失。虽然悬浮培养因其简单高效而受到重视，但基于微孔或孔板的静态自动创建软骨样微组织的技术也在探索中。这些系统的优势在于能够生产尺寸和形状高度均匀的微组织，并具有增强的可重复性，这对于GMP制造是必需的。市售微孔板（例如，Corning Elplasia板和StemCells AggreWell板）具有良好的光学特性，适用于自动成像和实时监控，而带有微孔的组织培养瓶（例如，Corning Elplasia 12K）则支持大规模微组织生产。虽然此类系统提供了高重复性，但也必须仔细考虑在工业规模上实施它们的潜在成本和可行性。静态培养系统中的细胞接种可以使用机器人系统自动化。例如，一个名为ReBiA的自动化机器人系统已用于创建3D上皮组织。该系统配备双臂机器人，能够完全自动化2D细胞扩增和将细胞种子接种到孔板中，以便在培养插入物或其他3D环境中自聚集。这样的液体处理机械臂可以与创建软骨样微组织的方法相结合，如最近一项研究所展示的那样。使用静态微孔培养系统时的一个剩余挑战是培养或培养基更换过程中微组织的移位。可能的解决方案包括在微孔上添加孔径为单细胞大小的膜，以防止自动处理过程中的移位，或使用更深的微孔。还开发了一种用于微孔板中软骨样微组织培养基更换的自动化系统，表明以更高速度吸液和分配培养基不会影响微组织，从而允许快速处理。JointPromise平台的概念通过能够处理用于软骨微组织生产的各种微孔形状来结合这些想法。生成微组织的一种简单且低成本的方法是悬滴法，其中细胞悬浮液的小液滴被分配到非粘附基底上，然后倒置。重力驱动细胞在液滴最低点聚集，促进其自组装成微组织。已努力通过构建一个集成细胞悬浮液混合和非接触式压电分配器的液体处理平台来自动化这一概念。此外，在该系统中，微组织可以通过单步离心从液滴中轻松回收。市售悬滴板（例如，InSphero Akura）也与自动化液体处理系统兼容，并允许轻松转移到球体培养板。最后，微流控悬滴系统已被开发用于实现自动培养基更新并延长微组织在液滴中的培养时间。然而，悬滴法产生的微组织比其他微组织生产系统尺寸更小、细胞更少。
**4. 用于软骨植入物生成的自动化和可扩展微组织组装**
**4.1. 微组织组装**
为了从微组织组装成更大的组织结构，已广泛研究了多种方法并进行了全面综述。通常，它们可分为自上而下和自下而上的方法。自上而下的方法依赖于支架，单细胞可以接种其上，并能提供即时刚度、图案化以及对起始条件的良好控制。例如，接种到具有一定胶原和丝素蛋白成分的支架上的ADSCs显示出增殖和向软骨形成细胞的分化，证明了支架如何调控细胞行为。然而，自上而下的方法受到非均匀细胞接种、对不同表型细胞进行空间组织的可能性受限以及组织发育过程中可重复性和可控性差的限制。因此，这些方法通常不适合可扩展的组织制造。这些局限性可以通过自下而上的组织工程技术来解决，其中小的微组织作为模块化构建模块。例如，软骨样微组织可以放置在一起，在受限环境中融合并自组装成大规模软骨构建物。自组装是一种典型的无支架、本质上是细胞驱动的方法，通过自发微组织融合生成更大的宏观组织。原位微组织自组装已在软骨修复中显示出临床疗效，正如最近使用基于球体的ACI研究所证明的那样。对于受控培养条件下的体外自组装，通常使用低粘附材料（如琼脂糖）来制造用于微组织接种的宏观孔。这些非粘附性孔可防止细胞附着，促进微组织融合，并提供空间约束。该方法用于生产由基因不同的软骨微组织群体组成的骨软骨植入物，这些微组织在皮下植入前允许在受限空间中融合。类似地，在另一项研究中，通过融合琼脂糖孔中的微组织成功创建了直径为10 mm2的软骨构建物。虽然这种方法允许生成相对较大的软骨构建物，但其受支架壁的限制有限，导致因细胞介导的收缩而产生形状变化。为了约束不受控的融合和形状变化，可以在构建物的上方和下方使用支架网进行微组织融合。然而，自组装的软骨构建物通常缺乏ECM中天然II型胶原的组织，导致亚优的力学性能。然而，可以在结构的成熟过程中使用生物反应器系统内的力学刺激或生化刺激方法来诱导胶原排列。最近研究表明，从底部使用TGF-β1刺激融合的软骨微组织导致增强的II型胶原排列。因此，这些自下而上的自组装方法简单且相对易于放大，但通常面临在实现可重复构建物几何形状和力学稳定性方面的挑战。为了实现微组织的精确定位，从而对组织结构和与生物材料的整合提供更大控制，已探索了自上而下和自下而上方法的组合，即所谓的中出方法。加入支架为工程化构建物提供了即时力学强度，并能够实现生物活性因子的局部递送。具体来说，不同表型细胞制成的微组织可以空间上放置在这样的框架中，以实现组织化。这些方法通常使用3D打印聚合物支架，例如具有微米级孔径的熔融电纺丝（MEW）纤维网。已经开发了生物制造策略，以实现微组织在这些支架中的受控空间图案化，这是整体浇铸方法无法可靠达到的组织控制水平。因此，这些策略有望引导融合和ECM形成，并生成具有预定义形状和尺寸的功能性构建物。通过将两种表型不同的软骨微组织群体空间放置在3D聚合物支架内，从而重建区域化的软骨-骨界面，已经证明了生物组装骨软骨植入物的可行性。对于软骨植入物的全自动生物制造，生物打印和生物组装系统是强大的工具。在软骨组织工程中，已经开发并继续探索几种生物制造策略，包括挤出式生物打印、激光辅助生物打印、抽吸辅助生物打印和Kenzan法。首先，最常用的技术是挤出式生物打印，它允许沉积负载球体的水凝胶，能够快速制造宏观尺度构建物，并以相对较低的成本和技术复杂度提供可扩展性，使其成为上述方法中最易获取的方法。例如，它已被用于将软骨样微组织置于氧化海藻酸盐水凝胶中，该水凝胶快速降解，最终创建无支架的放大软骨移植物。对于基于支架的中出方法，挤出式生物打印可以与MEW融合，用于将细胞负载水凝胶沉积在MEW PCL支架内。然而，这种生物打印方法需要基于生物材料的生物墨水，由水凝胶内的微组织组成，并且其空间分辨率本质上受限于喷嘴直径。其次，激光诱导前向转移（LIFT）是一种基于液滴的生物打印方法，最近被探索用于球体图案化。其无喷嘴机制防止堵塞并确保高位置精度，使其特别适合将球体排列在支架中形成分区组织的软骨结构。此外，LIFT与低粘度生物墨水兼容，可用于沉积悬浮在培养基中的微组织，与挤出式方法相比减少了对生物材料的依赖。然而，其通量相对较低，限制了其在生产大规模球体软骨构建物中的效用。为了解决这个问题，已报道了迈向自动化的努力，包括集成计算机辅助实时成像分析以实现实时球体识别和靶向转移。尽管如此，LIFT生物打印仍然是一种技术要求高的方法。第三，一些研究团队开发了抽吸辅助生物打印系统，将机器人操作与实时自动成像相结合，以促进微组织的处理并将其组装成大型有序构建物。该技术可以集中于图像引导的机器人拾取-放置系统，例如CellCelector?和SpheroidPicker。一种类似的技术，称为Pick-Flow-Drop，已被开发出来，其中微组织从微组织悬浮液储存器中被成像和抽吸（效率为98.1%），并分配到孔板中的精确位置（效率为98.4%）。与挤出式生物打印相比，基于抽吸的方法本质上更耗时，但在微组织定位方面提供了极大的控制，可与LIFT生物打印相媲美。为了提高可扩展性，最近引入了HITS-Bio（高通量集成组织生物打印系统），其中球体可以精确定位，速度比传统抽吸辅助生物打印快5倍。在生物材料依赖性方面，该方法不需要基于水凝胶的生物墨水，尽管通常引入支撑性或牺牲性水凝胶以在打印后保持微组织定位。然而，在中出方法中使用生物材料作为支架的缺点是其中一些可能会干扰体内的再生和重塑。例如，无论是聚合物还是水凝胶基的支架，都应该是可生物降解的，并具有合适的力学特性，以促进基质转换而不是抑制新生组织形成和生长。因此，从监管角度来看，无支架方法可能更简单，因为监管机构批准的生物材料仍然有限。抽吸辅助生物打印技术也可用于生产无支架构建物。例如，由ADSCs及其软骨形成ECM组成的软骨微组织可以被抽吸并放置在融合后移除的销钉之间。此外，水凝胶也可用作临时支撑。MSC微组织已被抽吸并精确打印在海藻酸盐基底上，随后用海藻酸盐覆盖。融合后，可以用柠檬酸钠去除海藻酸盐，从而产生完全无支架的构建物。最后，一种产生无支架构建物的成熟生物组装策略是Kenzan法，其中微组织通过自动机器人系统放置在微针阵列上并固定直至融合。已证明使用iPSC来源的微组织和ADSCs微组织，通过Kenzan法可生产面积达6 cm2的无支架软骨移植物。Kenzan法提供了与LIFT和抽吸辅助生物打印相当的空间精度，但受限于微组织尺寸和固定的针阵列。此外，Kenzan法面临规模化限制，包括需要大量具有适当ECM沉积的均匀球体以及在构建物获得功能性力学强度之前较长的融合时间，使其技术上复杂且实施成本高昂。除了这些已建立的微组织组装策略外，生物制造领域的一项新兴技术是冷冻生物打印，它将生物打印与冷冻保存方法相结合。通过实现可存储、运输和按需植入的即用型构建物的制造，冷冻生物打印可以大大减少生产时间和物流限制。在冷冻生物打印过程中，冷冻过程允许通过调整参数（如基底和打印床温度）来控制构建物的孔隙度和各向异性。例如，冷冻打印可以与静电纺丝技术相结合，从而能够制造高度多孔、多区域的支架，更好地模拟天然软骨的结构并支持软骨形成分化。尽管仍处于早期开发阶段，但在工艺设计早期考虑冷冻生物打印可能会为更标准化和可扩展的软骨植入物生产提供机会。
**4.2. 基于微组织的工程化软骨构建物的成熟**
成熟是基于微组织的软骨工程中一个重要的步骤，其中细胞根据力学和生化刺激将基质重塑成具有力学功能的组织。组织成熟必须在体内（如基于微组织的ACI所见，需要延长的康复方案延迟完全负重）或通过植入前工程化组织的体外软骨形成成熟，然后采用适当的康复方案以确保良好整合。例如，可以通过对组织施加载荷、生长因子和低氧张力来促进这种成熟。力学刺激可通过施加循环压缩、剪切应力或静水压力来实现。Neocart是一种软骨组织工程植入物，它在模拟关节环境（氧张力、静水压力和流速）的生物反应器中成熟。然而，Neocart在2019年III期随机对照优效性试验结束后因与微骨折治疗相比改善证据不足而终止。为了完全自动化软骨植入物开发，添加一种自动化、标准化且符合GMP的成熟方法是可取的，例如，具有单向或双向流动的自动灌注生物反应器，对组织施加剪切应力。在这种情况下，可以使用一次性生物反应器来降低成本并保持无菌。此外，对于定制化，可以考虑根据图像重建的患者特定几何形状3D打印生物反应器。FABRICA是一种设计用于多种组织的3D打印生物反应器，可以对组织进行培养、灌注和实时观察。已开发出一种自动生物反应器系统，对负载人ACs的水凝胶施加直接力学刺激（单向或双轴剪切和压缩），这刺激了软骨形成潜力和ECM产生。
**5. 自动化流程监测与质量控制**
质量措施（最好是自动化的）对于确保产品持续按照定义的质量标准生产（基于GMP法规）至关重要。对于任何基于细胞的产品，控制细胞特性和纯度（包括存在非靶细胞、微生物和培养过程中的残留材料）是必不可少的。例如，iPSC来源的细胞在使用前应进行质量监测以确认不存在非靶细胞。对于自体细胞，也需要对肥大或成纤维细胞标志物进行标准化质量检查以实现安全性和有效性，因为供体间的变异是不可避免的。对于同种异体细胞，安全性测试应包括免疫原性、致瘤潜力和遗传稳定性分析。常用的检测方法包括流式细胞术、定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）和核型分析。系统还应能够检测支原体、内毒素和其他质量指标，如细胞活力。当从细胞过渡到微组织时，高速显微镜可以集成到自动化平台中，通过计算机视觉算法直接评估微组织的质量，这些算法可以确定尺寸、形状和空孔。尽管这在搅拌悬浮培养和静态培养中均有描述，但监测静态培养而不牺牲微组织似乎更容易实现。为了表征微组织中细胞表型的异质性，可以使用结合基于卷积神经网络算法的3D分割分析细胞核和分类微组织形态的高速3D成像。最后，为了确保产品质量和功能，应包括效力释放测试，例如测量微组织中软骨蛋白的表达水平。集成质量控制以及对监管机构的合规性对于使用微组织的生物打印也至关重要，特别是在挤出式系统中，由于其开环性质，这些系统本质上容易出现可重复性挑战。在此类系统中，输出没有被测量，因此没有被用作实时调整过程的反馈。打印过程对生物墨水特性和环境条件的变化高度敏感，这些变化可能引起差异，从而损害组织构建物的结构和功能。最近，开发了一种原位质量监测系统，该系统允许通过集成高分辨率相机实时监测打印质量，并生成视觉数据记录，作为生物打印过程的审计证据。类似地，通过将液体流量传感器集成到气动驱动挤出式生物打印机中，建立了一种实时监测策略。该传感器能够持续监测和控制分配墨水的流速，同时基于Python的软件工具实时处理数据以动态调整挤出压力。在微组织成功组装成更大的软骨构建物后，需要自动化、非侵入性的方法来评估工程化组织。对于厚度达约3 mm的工程化构建物中ECM生物分子（特别是GAG含量）的定量，可以通过光纤拉曼光谱结合机器学习（ML）进行非侵入性监测。最近研究表明，可见光和近红外范围内的光谱学，当与ML模型结合时，能够实现DNA和GAG含量的无损分析，并预测构建物的整体成熟度。除了构建物的生化组成外，其力学特性的定量对于确定成功的组织功能同样重要。基于光纤的荧光寿命成像已被用于无损评估工程化软骨构建物的生化组成，并开发了算法将这些光学测量与其力学特性准确关联。对于整体培养，反馈回路对于评估环境的温度、氧气、二氧化碳和感染迹象非常重要。为了进一步优化培养并预测生物反应器中的过程和结果，计算机模拟模型可能有用。特别是当最终产品需要患者特异性细胞或几何形状时，数字孪生是有价值的。这些是物理对应物的实时虚拟表示（例如，模拟再现患者特异性环境），可以帮助预测哪些参数（包括培养持续时间或力学刺激）是最佳的。此外，以符合GMP的方式进行自动清洁通常不被讨论；然而，它将减少系统的停机时间。自动清洁的例子可以是用过氧化氢气体配合擦拭消毒，或使用带有消毒产品的喷嘴，并用灭菌空气干燥。或者，对于生产过程中与细胞接触的所有部分，可以使用一次性组件。
**6. 监管考量**
**6.1. 先进治疗药品（ATMP）的监管框架**
截至2025年2月，在欧洲只有两种属于先进治疗药品（ATMP）类别的组织工程产品（TEP）获得了EMA的上市许可，即2015年批准的Holoclar和2017年批准的Spherox。Holoclar是一种针对受损角膜患者的疗法，是第一个使用干细胞的获批ATMP。Spherox是一种ACI形式，通过将预培养的自体AC微组织接种到软骨缺损处进行治疗。EMA将用于治疗的注射或植入药品分类为ATMP，如果它们由处理过的组织、细胞或基因组成。例如，仅经过分离和洗涤的自体ACs进行的ACI不被分类为ATMP，因为细胞未经处理。然而，如果在植入前细胞经过扩增（因此被处理），则该疗法属于ATMP类别。人们对ATMP非常感兴趣，因为它们可以为其他传统治疗策略效果不佳的疾病提供解决方案。此外，由于它们可以针对个体患者进行定制（有时使用患者特异性材料），因此它们被广泛研究用于个性化医疗的可能性。为了获得EMA的上市许可，必须证明产品的有效性、安全性和质量，并且产品必须按照GMP法规生产并遵循良好临床实践向患者介绍。ATMP的质量特性需要通过化学、制造和控制（CMC）研究来证明，该研究显示通过验证的制造过程可以持续获得标准化和受控的ATMP。同时，应在非临床试验和临床试验中评估安全性，尤其是在I期。此外，向已经获得监管批准的过程引入过程更改（例如引入新型自动化技术），可能需要进行广泛的对比性和验证测试，以验证更改的过程条件和方法不会引起产品质量变化。这强调了在TEP或ATMP制造流程的开发早期考虑GMP方法、可扩展性、自动化、标准化、质量控制和监管方面的成本效益的重要性。同样，监管考量也适用于用于生物打印软骨构建物的生物墨水的GMP合规性，以确保安全性、可重复性和监管接受性。细胞负载的生物墨水被认为是ATMP，需要进行供体资格验证、无菌制造策略和严格的无菌控制，包括经验证的内毒素检测。由于配方和应用不断演变，生物墨水法规很复杂。它们必须具有明确规定的组成和规格，以及经过验证的分析方法来评估关键特性，如粘度、pH、渗透压和流变学。所有组件和过程的全面文件记录和可追溯性对于满足监管要求和确保患者安全也是必不可少的。这导致了符合GMP的生物墨水可用性有限，从而在采用生物打印技术生产TEP的过程中造成了瓶颈。除了2007年第一个将组织工程产品纳入其框架的EMA外，全球还有其他管理机构负责管理这些产品。例如，FDA负责美国的监管决策，日本药品和医疗器械管理局（PMDA）负责日本的监管。组织工程植入物的评估和分类可能因这些机构而异。FDA将这些产品分类为人体细胞、组织以及细胞和组织制品（HCT/Ps）。与EMA相比，FDA将植入物区分为低风险、中风险或高风险。最低限度加工的产品被分类为低风险和中等风险类别，并且可以快速进入市场，因为不需要上市前批准。高风险类别（通常包括组织工程产品）确实需要上市前批准，审查过程需要十二个月。相比之下，EMA通常在九到十个月内就提交的申请做出批准决定。日本的PMDA提供了一种额外的加速途径，称为有条件且有时限的早期批准。要符合条件，开发者必须用临床数据证明该产品对于尚无成功治疗方法的疾病的安全性和有效性。自2014年起可用的这条途径为快速将新创新带给患者提供了重要机会，并通过避免漫长的临床试验为制造商节省资金。然而，当产品不符合这种缩短的路径时，可能需要长达七年的时间才能获得批准。为了进一步加速世界范围内组织工程植入物的临床应用，该领域将受益于国际化的流程、要求和决策组织。除了为患者提供合适的组织工程解决方案外，这种协调还将提高制造的成本效益。基于可量化的数据自动评估组织工程构建物的质量将进一步提高系统的成本效益，因为它与耗时的手动分析相比减少了使用者差异或错误。然而，在再生组织工程中使用人工智能（AI）会带来额外的监管义务。基于AI的系统应该是透明的，这意味着AI算法做出的决策应该是可理解的。此外，必须考虑关于安全性、模型训练、患者隐私以及系统所做决策的问责制的法规。根据EMA指南，应制定系统风险管理计划（尤其是在人工监督有限的情况下），以识别算法故障模式的潜在风险。此外，如果在制造过程中使用患者数据，则必须确保数据隐私（通用数据保护条例，GDPR）和问责制。最后，当基于AI/ML的系统影响软骨移植物设计或临床应用时，它们可能被归类为医疗器械，并在欧洲需要进行CE标志。
**6.2. 受监管环境中的可扩展性与成本效益**
在开发临床功能性组织工程植入物的同时，应优化成本效益以确保其可负担性。组织工程中两个主要的成本驱动因素是人员以及GMP合规设施（如洁净室）的运营和认证。使用带有自动清洁的自动化封闭系统有助于降低生产成本，因为需要的人员更少，同时最小化了必要洁净室设施的占地面积。连续机器操作（24/7）可以进一步提高产品的成本效益，而自动化也增强了稳健性和可重复性，因为更少的人为错误发生，从而节省更多成本。在自动化系统中使用类似尺寸的耗材（如培养瓶和试管）也能提高成本效益，因为减少了彻底清洁和验证所需的时间，尤其是在使用供体材料时。即使自动化ATMP生产过程中的单个步骤也能显著提高成本效益。例如，与八年的手动生产相比，使用上述StemCellFactory生产iPSCs的成本要低42%，尽管自动化系统的投资成本翻了一番。最大的节省归因于员工成本的大幅降低。在组织工程的其他领域，已经开发了一种用于制造个性化皮肤移植物的全封闭自动化程序。在该程序中，来自患者的活检用于在大约四周内将皮肤移植物的尺寸扩大约100倍。所开发的系统由三个隔室组成，用于从活检中分离细胞、细胞扩增和皮肤形成。在更大的生产过程中使用这种模块化方法也可能会提高成本效益。如果需要维修或更新，只需更换一个模块，系统的其余部分可保持不变。此外，长期的成熟步骤本质上成本高昂，而这些模块化系统中组件可以交换用于下一个组织的生产，可能进一步降低总体成本。为了确保具有成本效益和效率的产品，需要多个领域（如生物工程师、生物学家、医生、护士、软件工程师和电气工程师）之间的合作。经常被忽视但对于新TEP的长期稳定性至关重要的学科是有关定价和报销的经济学与政策。鉴于大多数ATMP通常是一次性治疗方法且前期成本高，传统的支付模式不足以捕捉其长期的治疗和经济价值。此外，欧洲目前针对ATMP的报销系统充满挑战，所有国家没有统一的流程。因此，应考虑替代性报销结构，如基于结果的协议和分期付款。应在设计过程中早期纳入经济学以及考虑到监管考量的临床前档案准备，以评估投资的成本效益和其他社会经济优势，例如降低长期医疗保健成本和更快地重返工作岗位。在成功、成本效益高且符合法规的工程化软骨植入物开发的设计过程中应早期考虑的关键因素已总结。
**7. 软骨组织工程的未来实验室**
研究人员展望以自动化和可扩展的方式，为软骨缺损患者进行符合GMP的软骨组织工程构建物的生产。自动化系统可以被视为一个lab-in-a-box概念，整个过程发生在一个封闭的盒子内。这导致了一个无菌环境，只需要对周围环境采用较低的国际标准化组织（ISO）标准，或允许使用较低等级的洁净室。环境持续受监测和控制，维持O₂和CO₂浓度、湿度和pH在预设值。自动化系统应包括自动清洁以保持随时运行。生产过程中需要用于不同部分的多个隔室，可以紧凑地组装。这一概念允许将此类自动化系统放置在护理点，与目前在其他地点生产的自体组织工程植入物相比，减少了物流挑战和成本。关于要添加到自动化系统中的隔室，研究人员设想它支持即用型细胞的冷冻储存和自体细胞的分离。可以使用悬浮培养以可扩展的方式扩增和成熟细胞并生产微组织。悬浮培养中的培养基更换可以通过管路自动化。在悬浮培养中生产微组织后，应基于细胞表型和ECM含量对微组织进行质量评估并收获。包括用于储存由即用型或同种异体细胞制成的微组织的冷冻隔室，通过增强过程的成本效益来增加价值。为了兼具自下而上和自上而下组织工程的优点，结合为中出方法，应根据患者的几何形状将微组织打印在3D打印支架中。应使用实现压缩和剪切应力的生物反应器进一步成熟该构建物。非侵入性质量检查，如使用明场显微镜实时评估微组织形态和聚集，或使用拉曼光谱评估构建物成熟度，应产生一个AI反馈回路，根据细胞、微组织和宏观组织的成熟和生长需求调整培养。强化学习（常用于基于机器人的系统）可用于让系统根据来自环境和质量检查的数据做出决策，以优化最终产品。能够操作培养硬件的机器人手臂可以促进细胞或构建物在不同隔室之间的移动。该平台应易于适应以集成新技术。使用具有可互换隔室的模块化系统可以在需要时无缝集成这些新技术或进行维修。
**8. 结论**
本综述强调，软骨微组织作为构建更大、功能性工程化软骨植入物的模块化组件已引起极大关注，因为它们比单细胞方法更能模拟天然组织组织。此外，微组织易于融入新型自动化和可扩展的制造技术中，增强了其临床转化潜力。然而，正如监管机构批准的少数组织工程植入物所表明的那样，在实现可扩展制造和完全集成的端到端制造工作流程方面仍然存在重大挑战。评估不同细胞来源与各种组装技术相结合以确定适合符合GMP和可扩展组织工程的组合的比较研究很少。解决微组织不完全重塑成连贯且力学稳定的组织这一关键限制，需要研究确定融合前的最佳微组织尺寸和成熟方案，以及有效的融合后成熟程序。此外，标准化和批准流程的开发受到可用制造材料的阻碍。幸运的是，对合规生物墨水和生物打印机需求的意识增强是一个很好的发展，可能有助于解决当前新组织工程植入物批准途径中的瓶颈。展望未来，完整生产过程的标准化需要不同专业之间的合作，其中从组织生产到基于AI的过程监测和自动清洁的质量控制等所有方面都得到优化。应着重于在设计过程早期实施和结合符合GMP、自动化、可扩展、社会经济和监管的概念。最终，这应该使我们更接近成本效益高且可扩展的组织工程解决方案，为患者创建即用型软骨构建物。