CNTNAP2敲除小鼠纹状体及皮质钙结合蛋白阳性中间神经元密度降低与社交行为改变相关

《Autism Research》：Lower Striatal and Cortical Calretinin Interneuron Density Associated With Altered Social Behavior in Cntnap2 Knockout Mice

　　

编码细胞黏附分子CASPR2的CNTNAP2基因变异已被确认为自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）的遗传风险因素。然而，CNTNAP2功能障碍改变神经环路功能的机制尚不清楚。中间神经元作为兴奋-抑制平衡的关键调节者，是潜在的脆弱性来源。本研究中，研究人员定量分析了Cntnap2敲除（Knockout, KO）和野生型（Wild-Type, WT）小鼠尾壳核（Caudoputamen, CP）及体感皮层（Somatosensory Cortex, SSC）中钙结合蛋白阳性（Calretinin-Positive, CR⁺）和小白蛋白阳性（Parvalbumin-Positive, PV⁺）中间神经元的密度，并评估其与社交行为的关系。Cntnap2 KO小鼠在两个脑区均表现出显著降低的CR⁺中间神经元密度，而PV⁺密度无显著差异。Cntnap2 KO雌性小鼠在社交新奇偏好测试中表现出与WT雌性相比的行为改变。Cntnap2 KO动物还表现出升高的"离开"反应，即社交退缩表型。相关分析显示，在KO组内，较高的纹状体CR⁺密度与更频繁和更长时间的"离开"行为相关。SSC中的CR⁺密度与该行为表型无相关性。结果表明，纹状体CR⁺中间神经元可能调节社交退缩行为的持续性和强度。总之，本研究发现揭示了Cntnap2 KO小鼠中CR⁺中间神经元密度的区域特异性改变，并发现了Cntnap2功能、纹状体中间神经元组织与社交退缩行为之间此前未被认识到的联系。结果突显了CR⁺中间神经元作为ASD中基底神经节功能改变潜在贡献者的作用，并强调了对遗传定义的风险模型进行环路层面分析的必要性。

本研究以Cntnap2基因敲除小鼠为模型，系统探究了CR⁺中间神经元密度改变与社交行为异常之间的关联，论文发表于《Autism Research》。研究背景方面，自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）是一种病因涉及遗传与环境因素复杂交互的异质性神经发育障碍，核心症状包括社交沟通缺陷及重复刻板行为。编码CASPR2（Contactin-Associated Protein-Like 2）蛋白的CNTNAP2基因被确认为ASD风险基因，其突变与皮质发育不良-局灶性癫痫综合征及ASD样特征相关。既往研究虽发现Cntnap2敲除小鼠存在神经元迁移异常、中间神经元密度改变及社交行为缺陷，但关于CR⁺中间神经元这一特定亚群的研究尚不充分。鉴于兴奋-抑制（Excitatory/Inhibitory, E/I）平衡失调在ASD中的关键作用，以及CR⁺中间神经元在调控环路功能中的潜在重要性，研究人员开展了该项研究，旨在揭示Cntnap2功能缺失如何通过影响特定中间神经元亚群进而改变社交行为。

研究人员采用B6.129(Cg)-Cntnap2^tm1Pele/J品系小鼠，通过异型合子繁育获得Cntnap2 KO及WT对照动物，雌雄各半，共24只，于6月龄（PM6）进行实验。行为学检测包括三箱社交新奇偏好测试和旷场直接社交互动测试，随后对相同动物进行灌流固定、石蜡包埋及免疫组织化学染色，针对CP及SSC（含上肢体、口部、鼻部三个功能亚区）进行CR⁺和PV⁺中间神经元定量分析，并采用随机森林分类模型及线性回归模型进行行为-组织学关联分析。

研究结果显示：在尾壳核CR⁺中间神经元密度方面，Cntnap2 KO小鼠较WT降低36%，该差异在雄性（降低32%）和雌性（降低40%）中均存在，无显著性别交互作用。在体感皮层CR⁺中间神经元密度方面，仅鼻部亚区KO组较WT降低39%，且该差异不具有层特异性；性别分层分析显示雌性显著降低而雄性呈下降趋势但未达显著。在PV⁺中间神经元密度及脑宏观结构方面，两组间PV⁺密度及CP面积、SSC皮层厚度均无显著差异，提示CR⁺中间神经元存在选择性脆弱性。在社交新奇偏好行为方面，Cntnap2 KO雌性在未知同类箱中停留时间显著少于WT雌性，在中间空箱停留时间显著多于WT雌性，且KO雌性对已知同类表现出显著偏好而WT雌性无此差异；雄性各组间无显著差异。在社交退缩行为方面，随机森林模型识别"离开""接近"和"被动社交"为最具预测性的行为特征；Cntnap2 KO小鼠"离开"行为的频率显著升高、持续时间显著延长、潜伏期显著缩短，且无显著性别差异。在CR⁺密度与社交行为的相关性方面，KO组内CP的CR⁺密度与"离开"行为的频率和持续时间呈正相关，该相关性在WT组不存在；SSC鼻部CR⁺密度与"离开"行为无相关性。

讨论部分，研究人员首先阐述了CR⁺中间神经元改变的可能机制：CR⁺密度降低可能源于CR蛋白表达下调或真正的细胞丢失，Cntnap2缺失可能通过影响中间神经元发育的多个层面间接导致CR⁺改变。研究强调了样本量、年龄和性别作为关键变量的重要性：本研究12只/基因型是迄今为止该模型最大的组织学队列，6月龄对应CR⁺神经元数量的发育峰值，且纳入雌性动物有助于捕捉ASD神经生物学改变的完整谱系。在行为-组织学关联的解释上，研究人员提出纹状体CR⁺中间神经元可能通过其去抑制作用调节社交退缩行为的持续性和强度，但也指出该相关性不能等同于因果关系，需结合Cntnap2缺失对直接通路棘状投射神经元内在兴奋性的直接影响以及皮质-纹状体输入异常等多重因素综合理解。

研究结论：本研究揭示了Cntnap2 KO小鼠中CR⁺中间神经元密度的区域特异性改变，并发现了此前未被认识的Cntnap2功能、纹状体中间神经元组织与社交退缩行为之间的联系。结果突显了CR⁺中间神经元作为ASD中基底神经节功能改变潜在贡献者的作用，并强调了对遗传定义的风险模型进行环路层面分析的必要性。