《BioMed Research International》：Molecular Identification and Antifungal Susceptibility Patterns of Candida Species in Pediatric Patients at Tabriz Children′s Hospital
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摘要：念珠菌(Candida)属种类是重要的机会性致病菌，尤其在免疫功能低下患儿中致病性显著。随着新生儿及儿科重症监护病房(NICU/PICU)侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis, IC)发病率上升，准确的菌种鉴定与抗真菌药物敏感性谱测定
摘要：念珠菌(Candida)属种类是重要的机会性致病菌，尤其在免疫功能低下患儿中致病性显著。随着新生儿及儿科重症监护病房(NICU/PICU)侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis, IC)发病率上升，准确的菌种鉴定与抗真菌药物敏感性谱测定对有效治疗至关重要。本研究为双阶段设计，旨在：(1)采用常规方法与分子方法[rDNA-内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)测序]对临床标本中分离的念珠菌进行菌种鉴定；(2)评估其对氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、两性霉素B(amphotericin B)及卡泊芬净(caspofungin)的抗真菌药物敏感性模式。共获取97株儿科患者临床分离株进行分子鉴定，其中67株成功传代培养并开展抗真菌药物敏感性试验(antifungal susceptibility testing, AST)。菌种鉴定包括选择性培养基培养、显微镜检查、DNA提取及ITS区测序；抗真菌药物敏感性试验按临床与实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) M27标准采用RPMI-1640培养基微量肉汤稀释法(broth microdilution)，35℃孵育48 h，肉眼判读最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)终点。分子鉴定结果显示分布为：光滑念珠菌(C. glabrata)50株(51.5%)、白色念珠菌/都柏林念珠菌复合体(C. albicans/C. dubliniensis complex)34株(35.1%)、产朊假丝酵母(C. kefyr)5株(5.2%)、克柔念珠菌(C. krusei)6株(6.2%)、热带念珠菌(C. tropicalis)2株(2.1%)。药敏试验显示氟康唑广泛耐药（尤见于C. glabrata、C. albicans及C. krusei）及两性霉素B耐药；伊曲康唑呈可变耐药（C. kefyr 100%敏感）；卡泊芬净各菌种间均高度敏感（敏感率97.4%–100%）。研究结果表明存在令人担忧的流行病学转变——向以C. glabrata为主的非白念珠菌(nonalbicans Candida species)偏移，且具独特耐药谱。尽管卡泊芬净仍高度有效，但所观察到的耐药模式强调有必要开展常规抗真菌药物敏感性试验以指导治疗，防止儿科念珠菌感染治疗失败。
论文解读：
【研究背景与意义】
侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis, IC)是院内尤其是新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit, NICU)及儿科重症监护病房(pediatric intensive care unit, PICU)重要的机会性感染，早产儿及免疫低下患儿易感，相关死亡率可达30%–75%。传统认为白色念珠菌(Candida albicans, C. albicans)为最主要致病菌，但近年非白念珠菌(nonalbicans Candida species, NACS)如光滑念珠菌(C. glabrata)、克柔念珠菌(C. krusei)占比上升且常伴有唑类耐药，加之表型鉴定方法难以区分近缘种（如C. albicans与都柏林念珠菌C. dubliniensis），给临床经验性治疗带来挑战。目前伊朗西北部地区儿科人群念珠菌菌种分布及耐药谱数据有限。因此研究人员在大不里士儿童医院(Tabriz Children's Hospital)开展本研究，通过分子生物学手段明确临床分离株菌种组成，并以CLSI标准评价常用抗真菌药物体外活性，为区域儿科侵袭性念珠菌感染精准诊治提供依据。本研究结果发表于《BioMed Research International》。
【主要关键技术方法概述】
研究人员回顾性收集2021年3月至2022年2月大不里士儿童医院NICU、PICU、感染科、内科、手术室及血液肿瘤科住院患儿临床标本（尿液、伤口拭子、脑脊液分流液、导管尖端、腹膜液、血培养等）分离保存的97株念珠菌临床分离株。分子鉴定采用煮沸法提取基因组DNA，PCR扩增rDNA-ITS区（引物ITS1/ITS4），琼脂糖凝胶电泳初判片段大小后双向测序，BLAST比对GenBank数据库（≥99%序列同源性、≥98%覆盖度）确定种水平；辅以CHROMagar Candida显色培养基菌落颜色及芽管试验(germinal tube test)做表型初筛。抗真菌药物敏感性试验按CLSI M27-A3/M27-S4指南对67株可复活分离株行RPMI-1640微量肉汤稀释法(broth microdilution)，测定氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B(amphotericin B)及卡泊芬un净(caspofungin)最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)，以Candida parapsilosis ATCC 22019和C. krusei ATCC 6258为质控菌株，参照CLSI临床折点或流行界值(epidemiological cutoff value, ECV)判定敏感/中介/耐药。
【研究结果】
3.1 念珠菌显色培养基(CHROMagar Candida)培养结果
经rDNA-ITS测序鉴定，97株分离株中C. glabrata 50株(51.5%，显白色菌落，ITS~871 bp，芽管阴性)为最常见；C. albicans/C. dubliniensis复合体34株(35.1%，显绿色菌落，ITS~535 bp，芽管阳性)；C. krusei 6株(6.2%，粉色菌落，ITS~510 bp)；C. kefyr 5株(5.2%，粉色菌落，ITS~748 bp)；C. tropicalis 2株(2.1%，蓝色菌落，ITS~524 bp)。标本来源以尿液(n=44)和伤口拭子(n=37)为主，科室分布以感染科、NICU及PICU居多，年龄多集中于2岁以下婴幼儿。结论：光滑念珠菌为当地儿科患者首要分离菌种，存在向非白念珠菌偏移的流行病学特征，表型显色与芽管试验结合ITS片段大小可提供快速初步鉴别。
3.2 芽管试验(Germinal Tube Test)结果
C. albicans/C. dubliniensis复合体分离株在牛血清孵育2 h后镜下可见典型无收缩发芽管，其余菌种均为阴性。结论：芽管试验可有效辅助鉴别C. albicans/C. dubliniensis与其他念珠菌种，但不能区分C. albicans与C. dubliniensis，需分子鉴定确认。
3.3 PCR反应结果
ITS区PCR扩增获得预期片段：C. albicans/dubliniensis ~535 bp、C. glabrata ~871 bp、C. kefyr ~748 bp、C. krusei ~510 bp、C. tropicalis ~524 bp；测序BLAST比对最终确定菌种。67株（38株C. glabrata、20株C. albicans、4株C. krusei、4株C. kefyr、1株C. tropicalis）成功传代并进入药敏试验。结论：ITS PCR结合测序是可靠且精确的念珠菌种水平鉴定手段，优于单纯表型方法。
3.3.1 抗真菌药物敏感性测定结果（MIC结果见表4）
详见表4各菌株四种药物MIC值。
3.4 分离念珠菌种对抗真菌药物的药敏模式(Drug Susceptibility Pattern)
对67株进行判读：C. glabrata(38株)氟康唑100%耐药、两性霉素B 100%耐药、伊曲康唑78.9%耐药(21.1%敏感)、卡泊芬净97.4%敏感(1株耐药)；C. albicans(20株)氟康唑95%耐药(5%敏感)、两性霉素B 80%耐药、伊曲康唑55%耐药(45%敏感)、卡泊芬净100%敏感；C. krusei(4株)氟康唑及两性霉素B均100%耐药、伊曲康唑75%耐药(25%敏感)、卡泊芬净100%敏感；C. kefyr(4株)氟康唑75%耐药、两性霉素B 75%耐药、伊曲康唑100%敏感、卡泊芬净100%敏感；C. tropicalis(1株)氟康唑及两性霉素B 100%耐药、伊曲康唑及卡泊芬净100%敏感。结论：当地儿科分离株尤其C. glabrata对氟康唑及两性霉素B高度耐药，伊曲康唑在不同种间差异明显，棘白菌素类如卡泊芬净体外保持优异抗菌活性。
【讨论与结论总结】
讨论指出本研究中非白念珠菌占比达56.7%，且C. glabrata为首位分离种，反映长期抗真菌药物暴露可能驱动菌种构成改变及耐药升高，与部分地区报道趋势一致。氟康唑低敏感率(仅约3%株敏感)与同类ICU研究相近，而卡泊芬净或脂质体两性霉素B宜作为中重度感染或既往唑类暴露患儿一线推荐。分子鉴定(ITS测序)较表型法更精准，尤其可区分C. albicans与C. dubliniensis及鉴定少见种。未来可借助多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)或全基因组测序深入解析耐药相关分子机制及传播链。
结论(Conclusion)：大不里士儿童医院儿科念珠菌感染以光滑念珠菌(C. glabrata)为主，标志向非白念珠菌偏移之流行病学转变。体外药敏提示氟康唑疗效有限，卡泊芬净(caspofungin)对各菌种高度有效，可作为潜在一线治疗选择；rDNA-ITS PCR分子鉴定较传统表型方法更快速可靠。研究结果强调对高危儿科人群实施准确菌种鉴定与常规抗真菌药物敏感性试验之必要性，以指导靶向治疗并防控耐药，改善患儿预后；后续需进一步临床研究优化治疗方案。
