《The Journal of Prosthetic Dentistry》：Effect of probiotics on oral biofilm formation on titanium and SLA implant surfaces: An in vitro and in situ study
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种植体周围生物膜（biofilm）形成是种植体周围病（peri-implant disease）的关键致病因素。尽管补充益生菌（probiotics）已被提出作为调节口腔生物膜的辅助策略，但其对种植体相关钛（titanium, Ti）表面早期生物膜发育的影响尚
种植体周围生物膜（biofilm）形成是种植体周围病（peri-implant disease）的关键致病因素。尽管补充益生菌（probiotics）已被提出作为调节口腔生物膜的辅助策略，但其对种植体相关钛（titanium, Ti）表面早期生物膜发育的影响尚不明确。本研究旨在评估罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）暴露是否影响机械加工（machined）及大颗粒酸蚀喷砂（airborne-particle abraded, large-grit, acid-etched, SLA）钛种植体表面早期生物膜的形成、结构及抗菌敏感性。研究采用两部分设计：体外多微生物生物膜在机械加工及SLA钛种植体表面圆片上形成2小时或24小时，分别置于对照（未处理）、安慰剂（油类载体）或益生菌条件下，评估活菌计数、代谢活性及生物量；在体研究采用随机、双盲、交叉腭部装置模型，在相同处理下于口内形成4天生物膜，评估微生物计数、代谢活性、生物膜结构及对0.12%氯己定（chlorhexidine, CHX）的敏感性。数据采用双因素方差分析（2-way ANOVA）及Tukey HSD检验进行分析（α=0.05）。体外结果显示，益生菌暴露增加了早期活菌计数及代谢活性（P<0.05），尤其在机械加工表面更为明显。24小时后，益生菌处理组活菌计数高于对照及安慰剂组，而生物量具有表面依赖性（P<0.05）。在体模型中，罗伊氏乳杆菌暴露未增加乳杆菌、厌氧菌或白色念珠菌（Candida albicans）计数；未处理SLA表面表现出较高的链球菌及总活菌计数，而安慰剂及益生菌处理的SLA表面则降至与机械加工钛相当的水平。益生菌处理生物膜呈现较为松散的结构。氯己定敏感性未发生改变。
种植体周围病是一类由生物膜相关多微生物群落与宿主免疫炎症反应之间复杂相互作用所引发的 prevalent 炎症性疾病，其发生受环境因素及全身因素调控。宿主与微生物群稳态（homeostasis）的破坏导致生态失调（dysbiosis），利于致病微生物持续存在，临床初期表现为种植体周围黏膜炎（peri-implant mucositis），进而可发展为以进行性骨吸收为特征的种植体周围炎（peri-implantitis），其患病率接近20%且呈上升趋势，造成重大经济负担。由于生物膜在种植材料表面的积累是种植体周围病的主要致病因素，有效的生物膜控制对种植体长期成功至关重要。然而，现有的机械及化学非手术清创方案临床效果有限且常为短期有效；传统抗菌治疗包括抗生素及消毒剂均缺乏选择性，同时清除共生菌及致病微生物，加剧抗菌药物耐药性。此外，种植体表面的复杂微地形形成保护性生态位，阻碍机械清创并挑战健康相关微生物群的重建。因此，预防及治疗策略应优先选择促进微生物稳态而非无差别抗菌抑制的方法。
益生菌治疗被定义为通过维持或恢复微生物平衡而赋予健康益处的活微生物，已被提出作为调节口腔微生物组向共生状态转化的策略。临床研究表明益生菌补充可能改善牙周及种植体周围条件的炎症参数，系统综述亦报告其在种植体周围炎管理中的潜在辅助效益。在口腔益生菌中，罗伊氏乳杆菌是研究最为广泛的菌种之一，以其安全性及免疫调节特性著称。然而，近期系统综述表明，支持罗伊氏乳杆菌预防或管理种植体周围病的证据仍然有限且不一致。目前证据不支持将益生菌作为种植体周围炎的独立治疗手段。体外研究多聚焦于分离微生物相互作用及短期方案，限制了临床外推；临床研究则常与抗生素联合评估益生菌。此外，关于益生菌治疗如何影响钛种植体表面的生物膜形成及组织化知之甚少。基于此，本概念验证研究旨在评估局部口腔暴露于罗伊氏乳杆菌对在体及体外形成的商业种植体及基台表面口腔生物膜活力、代谢活性及结构组织的影响。
研究人员采用两部分互补实验设计：体外多微生物生物膜模型以评估微生物黏附（2小时）及早期生物膜积累（24小时）；在体模型使用佩戴于受试者的腭部装置以在生理条件下评估4天口内生物膜形成。研究选用纯钛（commercially pure titanium, cpTi）圆片，包括模拟基台组件的机械加工表面（Ti）及模拟牙科种植体的SLA表面。实验设置三种条件：对照（无处理）、安慰剂（葵花籽油载体）及益生菌（罗伊氏乳杆菌DSM 17938，1×10? CFU/5滴）。体外阶段，生物膜采用混合刺激人唾液作为获得性膜（pellicle）形成底物及多微生物接种物，该验证模型可重现与临床种植体周围炎相似的多微生物组成。圆片经紫外线消毒后暴露于唾液30分钟以形成获得性膜，随后转移至含10%脑心浸液（brain heart infusion, BHI）培养基的24孔板中，37 °C、10% CO?条件下分别孵育2小时或24小时。培养后，非黏附细胞经0.9%氯化钠冲洗去除，生物膜经涡旋及标准化低强度超声处理收获。2小时模型中，安慰剂或益生菌于孵育前即刻施加；24小时模型中，于基线及12小时两次施加。生物膜通过哥伦比亚血琼脂（Columbia Blood Agar, CBA）进行总活菌计数，采用阿尔玛蓝（Alamar Blue）法检测代谢活性，并以干重法测定生物量。
在体阶段采用随机、双盲、交叉设计，两个4天实验期间隔7天洗脱期。腭部装置模型既往已验证可用于钛表面研究。装置含有机械加工或SLA表面的cpTi圆片（?1×5 mm），共6种实验条件：Ti对照、SLA对照、Ti安慰剂、SLA安慰剂、Ti益生菌及SLA益生菌。圆片嵌入自凝丙烯酸树脂腭部装置的凹槽中，低于表面1 mm并以0.2 mm塑料网覆盖保护。安慰剂或益生菌溶液每日两次（上午9:00及晚上8:00）施加。为促进生物膜积累，每日4次施加20%蔗糖溶液。4天后收集生物膜，随后进入洗脱期。样本经涡旋及超声处理后，进行系列稀释并接种于选择性培养基：乳杆菌选择琼脂（Lactobacillus Selection Agar, LSA）用于乳杆菌计数，CBA用于总活菌微生物，苛求厌氧琼脂（Fastidious Anaerobe Agar, FAA）用于总厌氧菌，MS琼脂（Mitis Salivarius Agar, MSA）用于链球菌，CHROMagar用于白色念珠菌。计数以log?? CFU/mL表示。代谢活性以XTT（2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧基苯胺）还原法检测，生物量以干重分析。生物膜结构及活力通过共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）及扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）评估。抗菌敏感性通过暴露于0.12%氯己定二葡糖酸盐30分钟后进行CFU测定及定性CLSM分析。
统计分析采用GraphPad Prism软件，以表面类型（Ti vs. SLA）及处理条件（对照、安慰剂、益生菌）为自变量，以微生物计数、代谢活性及生物量为因变量。圆片作为实验单位，聚焦材料相关生物膜反应而非受试者特异性效应。样本量（n=6/组）计算可检测约1 log?? CFU差异（α=0.05，检验效能80%）。采用Shapiro-Wilk及Levene检验评估正态性及方差齐性，CFU数据经log??转换，采用双因素方差分析及Tukey HSD事后检验。不同时间点（2小时、24小时、4天）及体外/在体阶段分别独立分析，未进行多重比较校正。CLSM及SEM数据采用描述性分析。
微生物黏附阶段（2小时），益生菌补充增加了两种钛表面的微生物黏附（Ti：6.36 ± 0.287；SLA：6.29 ± 0.151；P<0.001），双因素方差分析显示处理效应显著，而表面及表面×处理交互效应不显著。对照与安慰剂组间无显著差异。生物膜代谢活性呈相同趋势，益生菌处理组最高，且Ti略高于SLA（Ti：1.31 ± 0.071；SLA：1.05 ± 0.185；P<0.05）。持续24小时生物膜积累后，各组活菌计数均略有增加。益生菌处理组在Ti及SLA表面均显示更高总微生物负荷（Ti：6.57 ± 0.103；SLA：6.43 ± 0.113）高于对照及安慰剂组（P<0.001），而安慰剂组低于未处理及益生菌处理组。24小时代谢活性亦增加，Ti-益生菌及安慰剂条件与SLA底物上数值相似。24小时生物量干重在各组间无统计学差异。
4天在体生物膜选择性培养分析显示，无论表面类型如何，各组间乳杆菌、总厌氧菌或白色念珠菌计数均无差异。相反，总活菌计数（CBA）在未处理SLA表面高于Ti对照、SLA安慰剂及SLA益生菌表面（CSLA：7.95 ± 0.0973；CTi：7.41 ± 0.158；PLSLA：7.46 ± 0.112；PRSLA：7.59 ± 0.145；P<0.001）。4天时，对照条件下SLA代谢活性高于Ti（P<0.001），且对照生物膜高于安慰剂或益生菌处理生物膜；安慰剂与益生菌组间或处理内各表面间无差异。SLA安慰剂组干重生物量高于SLA益生菌组。
定性SEM观察显示，对照及安慰剂组形成多层生物膜，而益生菌处理生物膜较为松散、多孔，尤其在钛表面更为明显。CLSM图像显示所有条件下生物膜主要为活菌，益生菌处理样本显示异质性增加及局部信号强度降低。0.12%氯己定处理后，各处理组及任两表面间生物膜敏感性均无差异；所有微生物组或总活菌计数在CHX暴露后无差异。CLSM显示CHX处理后呈现层状生物膜，死细菌覆盖于活菌之上。
讨论部分，研究人员首先指出初始黏附是生物膜形成的关键阶段，此阶段与活跃生长相关但结构组织有限；因此，早期时间点的活菌计数增加不一定预示生物膜成熟或致病性进展。代谢活性增加反映了益生菌处理组较高的细菌计数。早期定殖可影响后续微生物群落的建立及组织化。在此情境下，代谢活性增加而生物量未比例增加，提示益生菌暴露有利于代谢活跃的早期定殖菌而非减少总细菌负荷。此效应在SLA表面代谢活性方面表现较弱，提示表面可能调节益生菌行为并影响生物膜发育。
临床研究中，辅助益生菌治疗与种植体周围黏膜炎患者临床结局改善相关，但不伴有一致的菌斑指数降低或选择性微生物抑制。这些临床观察与本次实验发现一致：益生菌暴露修饰了早期生物膜代谢活性及空间组织，但未减少总微生物负荷，支持生态学机制而非抗菌机制。
在体模型中，益生菌补充未减少总体生物膜形成或特定微生物组（如厌氧种或白色念珠菌）。对照条件下，SLA表面链球菌计数及代谢活性高于机械加工钛，符合粗糙度驱动的生物膜积累。油类载体或益生菌制剂的施加可能减弱了SLA表面相关的微生物负荷增加，同时维持各处理间乳杆菌、厌氧菌及白色念珠菌的相当水平。这些发现提示生物膜组装被调节而未促进致病性过度生长，支持生态学而非抗菌效应。体外与在体结果的不一致性进一步支持此生态学解释：益生菌暴露增加了体外控制条件下的微生物计数，但在体未观察类似效应，可能源于体外条件缺乏关键生态调节因子。因此，体外发现可能代表简化条件下放大的早期定殖反应，而在体模型捕获了这些初始效应在更复杂、生物学相关环境内的调节。
结构分析（SEM及CLSM）显示所有条件下主要为成熟、活菌生物膜，形态模式相似。然而，各组间尤其是SLA表面观察到生物膜组织的细微视觉差异。SLA表面益生菌处理标本显得组织较不致密、更为异质，生物量分布更为不连续；相反，对照及安慰剂组形成致密、融合的密切贴合表面微地形的生物膜。但此结构改变未伴随氯己定敏感性的改变。0.12% CHX暴露产生各处理及两表面间可比的活菌减少，提示益生菌补充未诱导更具消毒剂耐受性的生物膜表型，这在临床上有重要意义，因调节种植体周围生物膜的策略不可损害常规使用抗菌剂的疗效。
安慰剂条件对生物膜发展产生可测量效应，提示载体可能通过物理化学机制（包括界面相互作用及对黏附及扩散的影响）影响生物膜形成。尽管研究用油主要由酯化脂质组成，部分水解可能产生具有潜在抗菌活性的游离脂肪酸，但未直接评估。因此，观察到的效应不可完全归因于罗伊氏乳杆菌，油类应被视为潜在 contributing factor。
研究局限性包括：圆片在交叉阶段混合，无法进行受试者水平配对及重复测量分析；7天洗脱期未专门针对罗伊氏乳杆菌持久性定制，残留生态效应不可排除；评估多重结局未进行多重比较校正；时间作为独立条件分析，限制时间交互效应评估；观察期较短，结论限于早期生物膜发育；微生物评估依赖培养依赖性方法；仅测试单一菌株及给药方案；此外，油基载体影响生物膜积累，限制了载体与益生菌效应的分离。尽管存在这些局限，研究发现提供了支持进一步研究更长持续时间、多菌株及临床相关研究的机制性见解。
从临床角度，这些发现表明益生菌补充可能影响种植体周围生物膜发育而不干扰常规抗菌控制，可能有助于减弱粗糙度相关SLA表面生物膜积累并促进较不致密的生物膜组织化，可作为既定机械及化学菌斑控制措施的辅助策略。尽管不旨在替代标准种植体周围维护方案，益生菌方法可能有助于更有利的早期生物膜 profile，尤其在初始愈合或维护阶段。
研究结论：基于本体外及在体研究发现，得出以下结论——观察到的效应与生物膜组织改变而非抗菌抑制相关；罗伊氏乳杆菌补充影响钛种植体相关表面早期生物膜形成的微生物代谢，体外增加微生物活性及活菌计数，在体不增加总致病负荷或改变氯己定敏感性；益生菌效应具有表面依赖性，在SLA钛表面最为明显，以代谢活性衡量。
