DLGAP5通过促进自噬活性驱动肺腺癌细胞生长

《Canadian Respiratory Journal》：DLGAP5 Drives Lung Adenocarcinoma Cell Growth by Promoting Autophagy Activity

　　

背景：自噬(autophagy)参与肿瘤发生并在肿瘤细胞存活中发挥重要作用。本研究旨在阐明discs large同源关联蛋白5(DLGAP5)与自噬在肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)发展过程中的调控机制。方法：采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测DLGAP5表达；采用细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8, CCK-8)、5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)及流式细胞术检测细胞增殖与凋亡能力；采用Western blot和免疫荧光分析自噬相关蛋白；建立裸鼠异种移植瘤(xenograft tumor)模型评估体内肿瘤生长。结果：DLGAP5在LUAD细胞系中较16HBE细胞显著过表达，尤其在PC-9和A549细胞中。功能实验显示，DLGAP5功能缺失抑制细胞增殖并诱导凋亡，而在体外的及体内的实验中DLGAP5过表达具有相反效应。DLGAP5敲低后，自噬相关LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1表达下降，p62(SQSTM1)表达升高。此外，DLGAP5过表达所介导的细胞增殖增强、自噬活性上调及凋亡受抑，在经3-甲基腺嘌呤(3-MA, 自噬特异性抑制剂)处理后被显著逆转。结论：综上所述，DLGAP5可通过激活自噬活性促进LUAD细胞增殖并抑制凋亡，提示靶向DLGAP5可能是LUAD治疗的一种有前景的策略。

DLGAP5通过促进自噬活性驱动肺腺癌进展的机制研究——发表于《Canadian Respiratory Journal》

研究背景与立题依据

肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)是非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)中最常见的组织学亚型，目前晚期患者5年生存率仍不足20%。LUAD的发病机制复杂且尚未完全阐明，寻找新的诊断与治疗靶点至关重要。Discs large同源关联蛋白5(discs large homolog-associated protein 5, DLGAP5，又名HURP/DLG7)是一类细胞周期调控的微管相关蛋白，既往研究表明其在多种恶性肿瘤中高表达并促进肿瘤发生发展，且在LUAD中高表达与不良预后相关，但其具体作用机制及是否与自噬(autophagy)调控有关尚不清楚。自噬在肿瘤中具有双重作用，在多数情况下可通过抵抗营养缺乏和缺氧等逆境促进肿瘤细胞存活，LUAD中自噬激活可加剧肿瘤生长，因此明确DLGAP5是否通过调控自噬影响LUAD进展具有重要科学意义。

主要关键技术方法

研究人员选用正常人支气管上皮细胞系16HBE及LUAD细胞系CALU-3、NCI-H1975、A549、NCI-H1299、PC-9，通过转染shRNA(sh-DLGAP5)及过表达载体(OV-DLGAP5)进行基因沉默与过表达干预，部分实验联合自噬早期抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA, 10 mM)处理；采用RT-qPCR和Western blot检测DLGAP5及自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)，包括LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及p62/SQSTM1表达；通过CCK-8法和EdU染色检测细胞增殖，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，LC3B免疫荧光观察自噬体形成；建立BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型(sh-NC组与sh-DLGAP5组，n=5)，每周测量瘤体积，取材后行Ki-67免疫组化(immunohistochemistry, IHC)及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)凋亡染色，Western blot检测移植瘤组织自噬标志蛋白；数据采用t检验或单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计学处理。

研究结果

3.1 DLGAP5 was Abnormally Overexpressed in LUAD Cell Lines（DLGAP5在LUAD细胞系中异常高表达）

研究人员通过RT-qPCR和Western blot检测发现，与正常肺上皮细胞16HBE相比，DLGAP5的mRNA和蛋白水平在5株LUAD细胞系(CALU-3、PC-9、NCI-H1975、A549、NCI-H1299)中均显著升高，其中PC-9和A549细胞中表达最高，故选择此两株细胞用于后续实验。结论：DLGAP5在LUAD细胞系中异常过表达。

3.2 Repression of DLGAP5 Inhibited the Proliferation and Facilitated Apoptosis of LUAD Cells（敲低DLGAP5抑制LUAD细胞增殖并促进凋亡）

将sh-DLGAP5转染PC-9和A549细胞验证敲低效率后，CCK-8和EdU实验显示DLGAP5敲低组细胞增殖能力显著受抑；流式细胞术检测显示凋亡率显著升高。结论：DLGAP5功能缺失在体外发挥抗LUAD肿瘤作用，抑制增殖并诱导凋亡。

3.3 DLGAP5 Knockdown Downregulated the Autophagy Activity in LUAD Cells（敲低DLGAP5下调LUAD细胞自噬活性）

Western blot显示，DLGAP5敲低后LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平降低，p62蛋白水平升高；LC3B免疫荧光强度也明显减弱。结论：DLGAP5敲低可抑制LUAD细胞的自噬活性。

3.4 DLGAP5 Regulated the Proliferation and Apoptosis of LUAD Cells by Activating Autophagy Activity（DLGAP5通过激活自噬活性调控LUAD细胞增殖与凋亡）

OV-DLGAP5转染使DLGAP5、LC3-II/LC3-I比值及Beclin-1升高、p62降低，细胞活力增加、凋亡减少；而联合3-MA处理后，DLGAP5过表达对自噬标志物的改变及促增殖、抗凋亡效应均被显著逆转。结论：DLGAP5通过上调自噬活性促进LUAD细胞存活，该促癌作用可被自噬抑制剂消除。

3.5 Downregulation of DLGAP5 Inhibited Tumor Growth in Vivo（体内下调DLGAP5抑制肿瘤生长）

裸鼠皮下移植sh-DLGAP5-A549细胞后，与sh-NC组相比，移植瘤体积与重量减小，瘤组织DLGAP5表达降低，Ki-67阳性率下降，TUNEL阳性凋亡细胞增多，且瘤组织中LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1降低、p62升高。结论：DLGAP5下调在体内同样抑制LUAD肿瘤生长并削弱自噬活性。

讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究首次在LUAD中证实DLGAP5作为自噬上游正调控因子，通过增强自噬活性（表现为LC3-II/LC3-I比值升高、Beclin-1上调及p62降解增加）促进肿瘤细胞增殖并抑制凋亡，从而发挥致癌作用；自噬抑制剂3-MA可抵消DLGAP5过表达的促生存效应，进一步佐证了该通路依赖性。这一发现拓展了DLGAP5在LUAD中的致癌机制认识，提示DLGAP5诱导的自噬活化是LUAD潜在的精准干预靶点。未来需在独立LUAD临床队列中验证DLGAP5表达与预后关系，并深入解析DLGAP5调控自噬起始的具体分子信号。

结论原文翻译：综上所述，DLGAP5可通过激活自噬活性促进肺腺癌细胞增殖并抑制其凋亡，提示靶向DLGAP5可能是LUAD一种有前景的治疗策略。