《Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases》：Huatuo Zaizao pill alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in rhesus macaque and rat with middle cerebral artery obstruction
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目的：探讨华佗再造丸（Huatuo Zaizao Pill, HZP）如何改善神经功能，并在大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）缺血-再灌注模型急性期探究其潜在机制。方法：在恒河猴和大鼠中建立MCAO缺
目的：探讨华佗再造丸（Huatuo Zaizao Pill, HZP）如何改善神经功能，并在大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）缺血-再灌注模型急性期探究其潜在机制。方法：在恒河猴和大鼠中建立MCAO缺血-再灌注模型，评估脑梗死体积和神经功能损伤。此外，利用免疫荧光染色和蛋白质印迹（Western Blotting, WB）检测胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）和Bax蛋白的表达水平。结果：在恒河猴MCAO缺血-再灌注模型中，HZP组的梗死体积较模型组减少更多。HZP组的非人灵长类卒中量表（Non-Human Primate Stroke Scale, NHPSS）评分在卒中后16小时开始降低；与模型组相比，HZP组从48小时至14天的NHPSS评分显著降低。与对照组相比，模型组大鼠的脑梗死体积百分比显著增加，而HZP组则显著降低。此外，HZP组在粘附物移除试验中的时间显著缩短。免疫荧光和WB结果显示，模型组中GFAP和Bax的表达增加，而HZP治疗后这一变化可在一定程度上逆转。结论：HZP显著减轻恒河猴MCAO模型急性期症状，且其有益作用持续至恢复期。这种保护作用可能通过减轻神经炎症和抑制神经元凋亡来对抗脑缺血-再灌注损伤。本研究中恒河猴和大鼠模型的发现支持HZP作为急性脑梗死辅助性治疗药物的潜力。
该研究发表于《Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases》，旨在探讨中药复方制剂华佗再造丸（HZP）在急性脑梗死中的神经保护作用及其机制。
研究背景方面，急性脑梗死作为一种突发性的脑血管疾病，可导致永久性神经功能缺损甚至死亡，是全球性的重大公共卫生威胁。现有研究表明，及时恢复血供可挽救缺血半暗带并改善患者预后。缺血后数分钟内触发的炎症反应被认为是急性缺血性脑血管病的关键病理过程，且炎症显著影响急性脑梗死的临床预后。因此，临床管理应优先关注急性期炎症的调控以预防进一步的病理损伤。炎症级联反应的激活引发一系列病理反应，包括神经元凋亡和血-脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）破坏。活化的星形胶质细胞和小胶质细胞触发的炎症反应是缺血性脑损伤的主要贡献因素。脑梗死发生时，星形胶质细胞活化伴随标志性蛋白GFAP和波形蛋白（Vimentin）的上调。神经元损伤由多种相互关联的机制导致：兴奋性氨基酸过度释放、小胶质细胞介导的促炎细胞因子分泌以及缝隙连接蛋白下调，最终共同导致神经元凋亡和BBB破坏。传统中医药（Traditional Chinese Medicine, TCM）具有多成分、多靶点、多通路的作用特点，在急性脑梗死管理中具有独特优势。HZP是由川芎、马钱子（炮制后）、吴茱萸和冰片等组成的中药复方，已获批作为药品在全球29个国家和地区销售。初步证据显示HZP可促进神经干细胞增殖、增加神经元再生，并在MCAO模型中增强环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP Response Element-Binding Protein, CREB）和脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF）的表达。然而，HZP在急性脑梗死中的治疗结局及相应病理生理机制尚待深入探索。众多在MCAO急性脑梗死模型中验证成功的药物在后续临床试验中未能获得满意结果，其原因可能在于动物模型无法精确复制人类卒中的全部病理生理过程，且临床前实验中的药效评价方法难以成功转化为人类临床试验标准。因此，亟需采用更能模拟人类卒中的动物模型进行药效评价。该研究在啮齿类大鼠模型中探索HZP的作用机制，并以非人灵长类恒河猴为研究对象，开展了涵盖脑梗死急性期至恢复期的HZP药效学研究。
swimmers该研究采用了以下关键技术方法：在大鼠中，采用改良Longa线栓法建立MCAO缺血-再灌注模型，通过腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，将线栓经颈外动脉插入颈内动脉并推进至大脑中动脉起始部，闭塞90分钟；在恒河猴中，采用开颅手术建立MCAO缺血-再灌注模型，麻醉后暴露右侧大脑中动脉M1段，用动脉瘤夹夹闭90分钟后释放实现再灌注，术后4-5小时进行脑磁共振血管成像（Magnetic Resonance Angiography, MRA）确认MCA再通。MRI扫描使用3.0T磁共振扫描仪，扫描序列包括T2-FLAIR、弥散加权成像（Diffusion-Weighted Imaging, DWI）、T1WI和三维时间飞跃法MRA（3D-TOF MRA）。神经功能评估包括大鼠的平衡木试验和粘附物移除试验，以及恒河猴的NHPSS评分（该评分与临床NIHSS评分类似，涵盖意识状态、防御反应、握力反射、肢体运动功能、步态、旋转运动、运动迟缓、平衡控制、对外刺激反应及面部肌肉力量等11项指标，满分41分）。此外，研究采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride, TTC）染色评估脑梗死体积，免疫荧光染色检测GFAP表达，以及WB检测Bax蛋白表达。统计分析采用SPSS 25.0软件，大鼠数据采用单因素方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis H检验，恒河猴数据采用稳健方差估计的线性回归和广义估计方程（Generalized Estimating Equations, GEE）分析。
研究结果部分，研究者在"HZP减轻大鼠MCAO缺血-再灌注神经功能损伤并降低脑梗死体积百分比"中发现，与对照组相比，模型组平衡木试验评分显著升高（0.00±0.00 vs 0.83±0.75，p < 0.05），表明平衡和运动功能受损；HZP低剂量组和高剂量组较模型组不同程度降低了评分。在粘附物移除试验中，模型组完成时间显著长于对照组（3.33±1.13 vs 0.38±0.19，p < 0.01），而HZP两组显著缩短了该时间（1.66±0.36 vs 1.60±0.11，p < 0.01）。TTC染色显示，与对照组相比模型组缺血性脑改变显著更严重（2.96±2.29% vs 33.92±9.46%，p < 0.01）；HZP低剂量组和高剂量组的脑梗死体积百分比显著小于模型组（17.49±2.22% vs 12.90±8.88%，p < 0.01）。
在"HZP减少星形胶质细胞活化和凋亡"中，与对照组相比，模型组活化星形胶质细胞数量增加，GFAP荧光强度升高（p < 0.01）；HZP低剂量组和高剂量组较模型组显著减少了活化星形胶质细胞数量和GFAP荧光强度（p < 0.01）。WB分析显示，与对照组相比模型组凋亡相关蛋白Bax表达显著上调（0.80±0.15 vs 1.46±0.44，p < 0.01）；HZP治疗降低了Bax蛋白表达，高剂量组较低剂量组Bax表达降低更明显（0.83±0.20 vs 1.16±0.25，p < 0.01）。
在"HZP减轻恒河猴MCAO缺血-再灌注神经功能缺损"中，研究者评估了卒中后16小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天和14天的NHPSS评分。两组在MCAO后16小时无显著差异，但HZP组评分较低。与模型组相比，HZP组从2天至14天NHPSS评分降低（p < 0.05）；HZP组在14天NHPSS评分降至0，即与未受影响侧相比无明显异常。HZP治疗缓解了恒河猴神经功能缺损，给药后全身健康状况改善、体重增加。
在"HZP改善恒河猴MCAO缺血-再灌注梗死体积变化"中，研究者于3天、7天和28天通过DWI图像评估梗死体积变化。两组在3天和7天无显著差异；与模型组相比，HZP治疗显著减轻了7至28天间梗死体积的增加（p < 0.01），提示持续给予HZP可能控制梗死体积的进展。
讨论部分，研究者指出脑梗死主要源于脑血管突然闭塞导致脑血供骤然中断，MCA是此类闭塞事件的常见解剖部位，该模型因能有效模拟人类该病病理生理过程而被广泛采用。炎症激活和神经元凋亡是急性脑梗死中两个相互依赖、病理生理核心的机制，共同驱动疾病进展并导致继发性脑损伤。该研究利用大鼠和恒河猴MCAO急性脑梗死模型，获得充分证据证实HZP具有有益作用：显著改善行为评分、减小梗死体积。机制上，这一有益结果归因于HZP减轻星形胶质细胞活化和阻碍凋亡过程的能力，从而为急性脑梗死阐明了一种潜在治疗策略。
在卒中病理生理学中，星形胶质细胞具有关键作用。活化的小胶质细胞分泌IL-1α、TNF-α和C1q等物质，可触发星形胶质细胞的神经毒性反应并导致神经元凋亡。同时，反应性星形胶质细胞可通过活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）诱导的炎症反应加重缺血性损伤。缺血脑区ROS过度产生加剧炎症反应，导致神经元凋亡。Bax和Bcl-2是Bcl-2基因家族中调节凋亡的基因，其中Bax促进凋亡而Bcl-2抑制凋亡。缺血再灌注发生时，模型组凋亡相关蛋白Bax表达显著上调，HZP高剂量显著降低了脑组织中Bax蛋白的表达。
MCAO急性脑梗死大鼠行为测试结果表明，HZP组评分和时间值低于对照组，说明HZP组动物的平衡和运动功能显著增强。同时，TTC染色显示HZP组动物脑梗死面积显著减少，而模型组仍处于相对较高水平。通过免疫荧光检测MCAO缺血模型大鼠皮层星形胶质细胞数量，相对于对照组，模型组皮层星形胶质细胞数量显著增加，表明缺血脑区存在炎症；HZP治疗组缺血区星形胶质细胞数量显著减少，表明HZP可减轻脑炎症。这些结果与先前研究一致，即HZP可抑制NF-κB活化、减轻动脉粥样硬化并抑制Aβ
1-42诱导的炎症反应。
为验证HZP疗效，研究者通过开颅手术精心建立了恒河猴MCAO急性脑梗死模型，随后采用MRA确认实验动物MCA是否再通。结果表明，在恒河猴MCAO急性脑梗死模型中，HZP组NHPSS评分从卒中后16小时开始下降，提示HZP治疗对该非人灵长类急性脑梗死模型中的神经功能缺损进展具有潜在影响。在长达28天的给药期间，HZP组梗死体积减少更明显，强烈提示持续给予HZP可有效调控恒河猴梗死体积的动态变化。
恒河猴作为非人灵长类，在脑血管系统、脑代谢、灰白质比例、认知行为及生理等方面与人类高度相似，且能长期存活并接受多次动态成像和卒中量表检查。非人灵长类的感觉和运动功能神经行为测试可有效模拟临床评价指标，为临床前药物开发向临床转化提供重要依据。因此，非人灵长类比其他类型动物更适合模拟脑梗死从急性发作到恢复的整个过程，研究者选择恒河猴作为MCAO模型动物。MRI结果显示MCAO区域发生梗死伴明确的对侧神经功能缺损，且恒河猴MCAO模型可存活长达30天，更符合临床研究转化需求，为药效学和机制研究（包括早期卒中干预、卒中后康复、神经修复和再生）提供关键数据。
该研究中，恒河猴MCA夹闭90分钟以模拟脑梗死早期状态。术后MRA功能成像评估显示MCA闭塞后存在缺血，同时MRI的DWI序列显示缺血区高信号，这些数据表明恒河猴MCAO模型成功建立。由于每组恒河猴数量较少，基线时HZP组梗死体积大于模型组；较大梗死体积随时间造成严重损伤更多，导致HZP组3天时梗死体积变化大于模型组。但随着给药时间延长，HZP组28天时梗死体积减少较模型组更多，具有显著统计学意义。总之，持续给予HZP可显著控制急性期起的梗死体积变化，明显减轻恒河猴MCAO模型的急性症状。
NHPSS评分包含11项评价指标，可清晰反映相应缺血性梗死所致对侧肢体、视觉、触觉等变化。值得注意的是，NHPSS评分与临床NIHSS评分一致，可评估脑梗死急性期患者的药物疗效。该研究中HZP组NHPSS评分从16小时至14天降低，具体而言动物意识状态24小时恢复正常，抓握功能3天开始缓慢恢复。这些结果表明HZP干预越早，急性脑梗死症状改善越明显。此外，HZP可显著改善运动功能，如14天时动物步态及上下肢运动功能评分显著降低。上述结果表明，HZP可缓解恒河猴MCAO模型急性症状，且改善持续至恢复阶段。
在缺血性卒中药物治疗中，由于CYP2C19多态性和药物基因组学变异，氯吡格雷抵抗常见，需要使用不依赖氯吡格雷代谢的辅助治疗。HZP通过其活性成分包括川芎嗪、冰片和吴茱萸碱发挥多靶点抗血小板、抗炎和神经保护作用。临床证据表明，HZP可与氯吡格雷安全联用以改善合并症患者的神经功能恢复，且不增加出血风险。缺血性卒中涉及复杂病理生理机制，常伴有高血压、糖尿病和血脂异常等合并症。现有临床证据表明，HZP在伴有合并症的缺血性卒中患者中具有神经保护和康复作用，可安全联合常规溶栓和抗血小板治疗以改善神经功能恢复。该研究中恒河猴和大鼠的发现支持HZP作为缺血性卒中有效辅助性治疗药物。
该研究存在若干局限性：缺血-再灌注过程中星形胶质细胞炎症串扰的机制需进一步研究；恒河猴数量需增加；HZP改善卒中结局的具体机制以及整体抗炎作用均有待进一步阐明。
研究结论：HZP可显著减少大鼠脑梗死体积，明显减轻恒河猴MCAO模型急性期症状，且有益作用持续至恢复期。其作用机制可能与减轻炎症和凋亡有关。为扩大HZP在脑梗死治疗中的临床适用性，应进一步研究脑缺血-再灌注过程中星形胶质细胞炎症串扰的机制，以及HZP在脑梗死结局中的精确分子通路和整体抗炎特性。
