左侧与右侧结直肠癌的整合蛋白基因组（proteogenomic）特征分析

《MedComm》：Integrative Proteogenomic Characterization of Left-Sided and Right-Sided Colorectal Cancer

　　

研究人员对左侧与右侧结直肠癌（CRC）进行了整合蛋白基因组表征。既往研究已发现左侧与右侧CRC在胚胎起源、分子特征及临床表型上存在差异，这些差异导致靶向治疗与免疫治疗疗效不同。基于肿瘤偏侧性（tumor laterality）开展多组学表征有望推动CRC更精准的个体化治疗。研究人员对共计80对CRC患者的肿瘤组织及配对正常邻近组织（NATs）开展了全外显子测序（WES）、蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学测序的综合分析。结果显示，左侧CRC的发病机制主要与染色体不稳定（CIN）相关，而右侧CRC主要与非整倍体微卫星不稳定（MSI）相关。在肿瘤微环境方面，左侧CRC表现为微血管内皮细胞增殖占主导，右侧CRC则表现出M1巨噬细胞介导的MHC II类分子相关抗原提呈增强。此外，发展为高度微卫星不稳定（MSI-H）的错配修复缺陷（dMMR）比例在左侧CRC低于右侧CRC，表明偏侧性亚型间DNA损伤修复系统存在差异，进而导致免疫治疗疗效不同。该整合蛋白基因组研究系统阐明了左侧与右侧CRC间的分子异质性，为通过定制化治疗策略优化患者预后提供了依据。

中文标题为“左侧与右侧结直肠癌的整合蛋白基因组（proteogenomic）特征分析”，发表于《MedComm》。研究背景方面，结直肠癌（CRC）是全球及中国高发恶性肿瘤，基于解剖部位与胚胎起源可划分为右侧CRC（横结肠脾曲近端）与左侧CRC（横结肠脾曲及以远）。两者在临床、基因组与分子谱上存在显著差异，已被视为不同疾病实体：右侧CRC多伴高度微卫星不稳定（MSI-H）、CpG岛甲基化表型高度（CIMP-H）及BRAF突变，左侧CRC则富集APC、TP53突变及染色体不稳定（CIN）通路；在转移性CRC中，抗EGFR治疗仅对RAS野生型左侧CRC有效，免疫检查点抑制剂（如pembrolizumab）在右侧错配修复缺陷（dMMR）/MSI-H CRC中可改善无进展生存期（PFS），左侧则未见此获益。当前临床决策主要依赖TNM分期、MMR状态及RAS/BRAF突变谱，虽有蛋白基因组学研究识别出部分新生物标志物与靶点，但按肿瘤偏侧性（tumor laterality）系统表征CRC蛋白基因组景观的大规模队列研究仍属空白，阐明偏侧性驱动的差异机制对患者分层与个体化治疗至关重要。为此，研究人员开展了基于中国人群的多组学整合研究，对80对未经治疗的原发性CRC肿瘤组织与配对正常邻近组织（NATs）进行WES、蛋白质组与磷酸化蛋白质组测序，结合生物信息学分析与功能实验验证，系统描绘左侧与右侧CRC的基因组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组特征及肿瘤微环境差异，构建蛋白水平的分子分型并阐释偏侧性相关的治疗敏感性机制。研究得出结论：左侧CRC以CIN、增殖与血管生成通路为主，右侧CRC以MSI、免疫激活与抗原提呈通路为主；偏侧性差异导致dMMR背景下左侧CRC的TMB较低且CD274（PD-L1）上调不明显，削弱免疫治疗响应；蛋白亚型可进一步细分生物学行为与药物敏感性各异的人群；18q缺失是左侧CRC转移与不良预后的驱动事件；POLE蛋白低表达在右侧CRC中模拟了POLE突变的高TMB效应。该研究的重要意义在于首次在中国队列中提供了左侧与右侧CRC的整合蛋白基因组全景，弥补了单一组学表征的不足，为偏侧性整合的精准分型与个体化治疗策略提供了可行动的分子依据，论文发表于《MedComm》。

主要关键技术方法如下：研究人员采用回顾性收集北京大学首钢医院（PKUSG）-CRC队列80对治疗初治原发性CRC肿瘤与配对正常邻近组织（NATs），按偏侧性与MMR状态匹配以控制混杂；实验端开展全外显子测序（WES）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组与磷酸化蛋白质组检测，并进行质控与相关一致性分析；生物信息学端实施非阴性矩阵分解（NMF）突变特征解析、基因水平拷贝数变异（CNA）与蛋白/磷酸化蛋白丰度相关性分析（FDR<0.05）、差异表达蛋白（DEP）与磷酸化位点分析、KEGG/GO/GSEA通路富集、xCell与ESTIMATE肿瘤微环境免疫细胞及基质评分、激酶底物富集分析（KSEA）、基于ConsensusClusterPlus的无监督蛋白聚类分型、CausalPath因果互作网络分析、CD274水平预测模型（基于CPTAC与TCGA队列构建，Pearson相关性验证）；验证端利用类器官（organoid）构建与RNA-seq药物敏感性测试（GDSC2）、多重免疫荧光（mIF）标记（PanCK、CD34、CD68、CD163）定量、单细胞RNA测序（scRNA-seq，GSE236581）处理分析，并通过外部SYSUCC CRC队列与TCGA CRC队列进行部分结果复现。

研究结果

2.1 中国人群左侧与右侧CRC的蛋白质基因组分子谱描绘：研究人员通过对PKUSG-CRC队列80对样本WES、蛋白质组（鉴定8193个蛋白，保留6095个在>50%样本中检出的蛋白）、磷酸化蛋白质组（33796个高置信度磷酸化位点覆盖6815个磷酸化蛋白）检测，质控显示平台稳定（蛋白质组QC重复中位数相关系数0.973，磷酸化蛋白质组0.98）；肿瘤与NATs在蛋白与磷酸位点鉴定数上显著不同，肿瘤内部相关性中位数0.863、NATs为0.905反映肿瘤异质性；该部分建立了中国人群左侧与右侧CRC的多组学基准数据集。

2.2 左侧与右侧CRC的体细胞变异与突变谱：研究人员发现最常见突变基因为APC（74%）、TP53（59%）、KRAS（49%）；左侧CRC中位TMB（肿瘤突变负荷）为5.06非同义突变/Mb，显著低于右侧CRC的13.00非同义突变/Mb，而左侧CIN显著更高，印证左侧以CIN驱动、右侧以MSI驱动；APC与TP53突变在左侧CRC富集。NMF解析出4个突变特征：Sig2关联dMMR，Sig4关联POLE外切酶结构域突变；POLE突变（POLE^mut）Sig4活性高于POLE野生型（POLE^wt），且POLE蛋白表达与Sig4活性（Spearman R=-0.37，p=0.0019）、TMB（R=-0.39，p=0.0011）负相关；右侧CRC肿瘤及NATs中POLE表达均显著低于左侧，提示胚胎与肿瘤源性差异；POLE低表达与IFN-α、IFN-γ通路负相关性（GSEA），右侧CRC免疫激活更强。CNA分析显示左侧CRC有25个染色体级SCNA事件、更多基因水平获得（26.10%）与缺失（31.31%）；CNA-蛋白/磷酸蛋白显著对相关260271对与350700对（FDR<0.05），cis/trans热点在染色体7、8、13、15、20；转移相关比较发现2p缺失、15q缺失、18q缺失介导左侧CRC转移，其中18q缺失（18q del）与左侧CRC总生存（OS）较差相关（log-rank p=0.02），18q CN正相关通路为凋亡、负相关通路为G2/M checkpoint、E2F、MYC增殖通路，机制上18q del通过抑制凋亡并增强增殖驱动左侧CRC转移与不良预后。

2.3 CRC肿瘤组织对比NATs的蛋白质组与磷酸化蛋白质组特征：PCA显示肿瘤与NATs明显分离；鉴定1721个差异表达蛋白（DEP），1276个上调（富集RNA代谢、核糖体生物合成、DNA复制、DNA修复通路），445个下调（富集细胞色素P450药物代谢、细胞外基质组织、氧化磷酸化）；DNA复制（POLD1、RFC2）与DNA损伤修复（MSH2、MSH6）蛋白高表达关联不良预后。鉴定9个在>5%样本中肿瘤vs NATs≥2倍的癌-睾丸（CT）抗原，其中ATAD2、CTNNA2、KIF2C高表达预示不良预后，SPAG9高表达关联良好预后；94个高置信度 biomarker重叠部分已知CRC biomarker。磷酸化组PCA亦分离肿瘤/NATs；1528个肿瘤上调磷酸位点中1357个（81%）磷酸化变化幅度超过对应蛋白丰度变化；蛋白与磷酸化上调一致性Spearman R=0.58；729个CRC激活磷酸位点含RB1、CDK1、SOX9等，H2AFX S140高磷酸化（DNA双链断裂标志）在左侧CRC富集，PRKDC可能为H2AFX S140调控激酶；KSEA显示CDK1、CDK2、CSNK2A1等在肿瘤中活性差异，整合蛋白、磷酸化、激酶活性与药物靶点提名fostamatinib（SYK抑制剂）与ribociclib（CDK4/6抑制剂）为候选药物；VIPER推断TF活性：IRF4、TCF4、IKZF1、STAT3下调，CEBPB、EHF、ARID3A、MYBL2、STAT2、MYC上调，并构建CDK1/CDK5/MAP2K3—TF磷酸化调控网络驱动CRC进展。

2.4 从蛋白质组与磷酸化蛋白质组探讨左侧与右侧CRC差异：左侧vs右侧CRC差异蛋白44个左侧上调、69个右侧上调；左侧富集氧化磷酸化、细胞周期、线粒体翻译、凋亡通路，右侧富集免疫应答与抗原提呈通路；右侧特异性高表达MHC-II（HLA-DPB1、HLA-DRA、HLA-DRB3）而非MHC-I。xCell显示左侧CRC微血管内皮细胞浸润更高（Wilcoxon p=0.0023），CD34（微血管内皮标记）上调，且与细胞周期活性正相关；右侧CRC M1及M2巨噬细胞浸润更高，CD14、CD68（巨噬细胞标记）上调，抗原提呈富集主要由M1巨噬细胞驱动（Spearman p=0.36，p=0.0011）；多重免疫荧光验证左侧CD34⁺细胞多、右侧CD68⁺及CD163⁺巨噬细胞多。激酶活性显示左侧CRC CDK、MAPK、AKT、EGFR家族超活化，类器官药物敏感分析显示左侧对CDK抑制剂ribociclib、AZD5438及MAPK抑制剂selumetinib更敏感。蛋白水平确认dMMR CRC中MMR蛋白（MSH2、MSH3、MSH6）低表达、RPL22L1（MSI关联蛋白）高表达；GSEA显示dMMR CRC氧化磷酸化与IFN-γ通路上调；scRNA-seq显示左侧dMMR CRC血管生成评分高、右侧dMMR CRC抗原加工提呈评分高，右侧dMMR CRC中CLEC9A⁺常规树突状细胞（cDC）富集；按偏侧性分层，左侧dMMR CRC氧化磷酸化主导，右侧dMMR CRC IFN通路主导。pMMR CRC在左侧转移风险高于dMMR CRC，右侧无此差异；右侧dMMR CRC TMB显著高于左侧dMMR CRC（p=0.036），SYSUCC与TCGA验证右侧dMMR MSI-H比例更高（74.58% vs 34.48%）；CD274（PD-L1）估计水平在右侧dMMR CRC高于pMMR（p=0.016），左侧无此差异；机制上dMMR通过促进细胞增殖与抑制DNA损伤修复驱动TMB/MSI-H、新抗原提呈与免疫激活，但左侧dMMR CRC此轴减弱，致免疫治疗响应降低。

2.5 中国人群CRC蛋白质组分子亚型：无监督一致性聚类（k=4）得到CC1–CC4四个蛋白亚型：CC1（左侧为主，转移较多，MAPK家族激酶与蛋白（MAPK1、MAPK2K1、MAPK2K2）上调，MAPK活化亚型）、CC2（右侧为主，KEGG O-聚糖生物合成通路激活，糖基转移酶与黏蛋白（MUC2、MUC5AC）高表达，FOXA1磷酸化与HNF4G激活驱动，黏液表型）、CC3（右侧为主，ESTIMATE最高免疫/基质评分，IFN-γ、TNF-α、补体等免疫通路富集，“热肿瘤”免疫亚型）、CC4（左侧为主，转移较多，MYC、E2F、G2/M checkpoint增殖通路激活，CDK2/CDK4活性高，RB1、CDK1、TP53BP1多位点磷酸化，抗凋亡重编程，高增殖亚型）。CausalPath显示CC1以MAPK通路主导；CC2中FOXA1与HNF4G驱动O-聚糖生物合成；CC4中CDK1 Y15磷酸化与G2/M checkpoint强相关（R=0.71，p=1.5E-13），RB1磷酸化关联E2F信号。四个亚型具不同生物学属性与治疗敏感性：CC1靶向MAPK/EGFR，CC2靶向糖基转移酶，CC3适合免疫治疗，CC4适合细胞周期毒性药（5-FU、奥沙利铂）与CDK抑制剂。

讨论部分总结：左侧与右侧CRC在胚胎起源、表观基因组、基因组、转录组、蛋白质组及微生物组上均不同，导致预后与抗EGFR、免疫治疗响应差异。研究人员发现POLE蛋白低表达在右侧CRC中模拟POLE突变的高TMB与免疫激活效应，且POLE低表达在右侧NATs已存在，支持偏侧性胚胎起源差异；左侧CRC以CIN为主，18q缺失（含DCC、SMAD4等抑癌基因）特异介导左侧CRC转移与不良OS，通过抑制凋亡/增强增殖实现，未来需前瞻性试验评估18q del联合偏侧性指导治疗强度；右侧CRC dMMR/MSI-H比例高，dMMR致DNA损伤修复缺陷累积微卫星错误产生MSI-H，右侧dMMR更易进展为MSI-H（74.58% vs左侧34.48%）且TMB更高、CD274上调更显著，因而免疫治疗响应优于左侧dMMR CRC，左侧dMMR存在补偿性非MMR DNA修复系统削弱免疫原性；蛋白亚型CC1（MAPK活化，左侧为主）可用抗EGFR/MAPK抑制剂，CC2（黏液表型，右侧为主，FOXA1磷酸化/HNF4G驱动O-聚糖）可靶向糖基转移酶克服耐药，CC3（高免疫浸润，右侧为主）适合免疫治疗，CC4（高增殖，左侧为主，RB1-E2F抗凋亡）适合细胞周期毒性药与CDK抑制剂；该研究首次在中国队列提供左侧与右侧CRC整合蛋白基因组全景，弥补单一组学不足，提出偏侧性整合分型框架，但局限为单中心、非转移初治队列、bulk组织未完全解析空间异质性，未来需多中心前瞻性验证、纳入转移/靶向或免疫治疗后样本、结合空间单细胞蛋白基因组学深化机制。研究结论为：通过WES、蛋白质组与磷酸化蛋白质组测序揭示了左侧与右侧CRC的起源与肿瘤微环境差异，阐明两者免疫治疗疗效差异的潜在原因，提出新型蛋白分子亚型，为CRC精准诊断与治疗提供依据，推动偏侧性整合到CRC个体化决策中。