综述：儿科NIH研讨会：第三场——用于HIV预防研究的幼年非人灵长类动物模型的专业性与复杂性

《JOURNAL OF MEDICAL PRIMATOLOGY》：Pediatric NIH Workshop: Session III—Specialties and Complexities of Juvenile NHP Models for HIV Prevention Research

　　

非人灵长类动物（NHPs）已成为研究HIV致病机制、疫苗及治疗策略的不可或缺的模型。嵌合型猿猴/人免疫缺陷病毒（SHIV）的构建是通过将HIV-1 Env插入SIV（通常为SIVmac239）骨架中实现的，这些病毒对于评估HIV中和抗体（nAb）的动态变化及体内疗效至关重要，使得在非人灵长类动物中测试人广谱中和单克隆抗体（bNAbs）的保护效力成为可能。研究人员通过对原始构建体进行改进，开发出多种新型SHIV毒株，通过额外突变增强Env与猕猴CD4受体的结合能力，并持续进行进一步优化。尽管存在一定局限性，使用SHIV感染的非人灵长类动物模型已显著推动了HIV bNAb在成人和儿科应用中的进展。

**1 第三场会议报告摘要**

**1.1 Ann Hessell：围产期HIV感染非人灵长类动物模型：经验积累与未来转化应用**

Hessell博士汇报了其研究团队15余年在俄勒冈国家灵长类动物研究中心（ONPRC）利用恒河猴围产期HIV感染模型开展的研究成果。垂直传播是儿童HIV感染的主要途径，亟需针对新生儿的治疗方案以阻断感染或限制疾病进展。在该模型中，婴儿恒河猴的SHIV感染与人类婴儿HIV感染高度相似。研究旨在应对确定病毒储存库发生时间、部位及复杂性的挑战，核心科学问题包括：最早感染灶的检测时机、初始感染部位、病毒负荷分布范围、阻断储存库建立的干预窗口期，以及bNAbs联合应用能否延缓初始病毒扩增并降低快速逃逸风险。

**1.1.1 SHIV感染后24小时启动bNAb治疗**

实验方案采用1月龄Mamu B*08/B*17阴性恒河猴，经口暴露感染SHIV-SF162P3后给予bNAb鸡尾酒治疗。感染率达100%，未治疗对照动物呈现快速致病进程并产生适应性免疫应答缺陷。多数队列采用VRC07-523与PGT121联合方案（5–40 mg/kg，皮下给药），于SHIV感染后24小时启动治疗，并考察了重复给药与单次给药方案。

该研究首次证明bNAb早期暴露后预防（PEP）可清除感染并阻断储存库建立。研究发现SHIV在感染后24小时即已在多组织中建立感染，并明确了SHIV-SF162P3在婴儿猕猴中的感染动力学特征。未接受被动bNAbs治疗的婴儿在感染1天后即出现广泛的低水平感染性病灶；第7天时组织中存在广泛感染且病毒水平显著升高；第14天时所有淋巴组织及肠道组织均呈现高水平病毒。相比之下，于感染后第1、4、10天接受VRC07-523与PGT121治疗的婴儿，组织中仅检测到低水平病毒。尤为显著的是，第4天bNAb输注后，感染后1周（第7天）各组织中几乎检测不到病毒，至第14天尸检时所有组织均无感染证据。这些发现提示，通过被动转移递送bNAbs实现有效PEP以清除感染的窗口期仅限于暴露后最初数日，随着急性感染早期持续性储存库的快速建立，疗效急剧下降。

**1.1.2 抗逆转录病毒治疗（ART）联合bNAbs**

bNAbs的治疗应用前景广阔，其广泛临床应用正在推进中。尽管ART有效延长了患者生存期，但无法治愈，且儿童HIV治疗存在固有局限：药物半衰期短、需严格依从以维持母乳喂养暴露后的持续保护。即使近年来开发了低频给药的改良ART制剂，对婴幼儿而言显著固有毒性风险依然存在。尽管如此，ART仍是新生儿的一线防御手段。因此，研究团队开发了在婴儿猕猴模型中考察短期ART联合bNAs以延长阻断病毒感染窗口期的方案。研究表明，口服SHIV接种后30小时给予治疗可清除感染。仅接受21天三药ART方案（始于48小时）的婴儿呈现病毒血症阴性且组织中几乎无病毒。bNAb虽为毒性更低、持续时间更长的ART替代方案，但单独延迟至48小时给予bNAb仅能使半数动物实现严格控制，且未产生适应性免疫应答。近期研究显示，72小时启动短期ART（3周）的婴儿中，6例中有5例停药后反弹。值得注意的是，72小时联合短期ART与bNAb治疗后，6例中5例出现突破感染，但其中4例存在显著延迟。综上，bNAb或ART单独应用时，若能在口服SHIV暴露后30–48小时内给药，均可实现有效的暴露后预防；而bNAb联合短期ART可能将有效PEP窗口期延长至暴露后30–48小时。

**1.1.3 ART联合bNAbs及其他生物制剂**

研究团队正进一步优化bNAb治疗方案，探索联合其他生物制剂的增效策略。ONPRC与加州国家灵长类动物研究中心（CaNPRC）合作，正在测试bNAbs与Leronlimab（Cytodyne）的联合免疫治疗，后者作为CCR5阻断剂发挥作用。Leronlimab为人源化IgG4单克隆抗体，可结合CCR5，已在临床试验及非人灵长类中进行测试。研究表明，短期bNAbs与CCR5阻断联合免疫治疗可实现婴儿恒河猴的ART-free病毒控制。

HIV感染儿童（CLWH）面临终身ART依赖的挑战。ONPRC与Scripps Florida的Mauricio Martins合作开展的未发表研究中，多个婴儿队列正在SHIV感染婴儿猕猴中测试生物制剂的体内表达。该工作属于儿童青少年病毒消除计划（PAVE）的一部分——PAVE为Martin Delaney合作组织，专注于婴儿、儿童及青少年HIV治愈研究。

研究采用腺相关病毒9型（AAV9）载体单次注射，设计表达两种生物制剂：恒河猴化bNAb 10-1074-IgG2-LS及恒河猴源eCD4-IgG2-LS。10只1月龄恒河猴接受高剂量口服SHIV接种，1周后启动每日ART并注射表达上述两种生物制剂的AAV9载体；对照组接受相同高剂量口服SHIV接种并于1周后启动ART，但不给予AAV9载体注射。两组ART均持续30周后停药以观察反弹情况。研究监测了两种抗体的体内表达及血浆浓度。AAV9载体注射成功实现了抗体内源性表达，10只婴儿中7只于ART停药后阻止了病毒反弹，且病毒抑制维持至少达2年。AAV9介导的抗体表达在婴儿中表现极佳，可能提供单次注射即可实现数年病毒抑制的治疗模式。将治疗延迟至感染后3周的研究正在进行中。

**1.1.4 婴幼儿中枢神经系统（CNS）感染应对**

新近研究已开始探究婴儿早期CNS感染动力学及神经炎症。早期通过纳米胶囊递送bNAbs（n-VRC07-523 + n-PGT121）评估治疗效力的研究，为利用条形码SHIV改进bNAb靶向婴儿CNS感染的递送策略奠定了基础。

**1.1.5 SHIV婴儿模型在儿科人群中的独特应用**

在PAVE资助的新研究中，研究团队正优化免疫PET（immunoPET）成像作为非侵入性手段以可视化检测SHIV病毒储存库。应用目标包括：开发儿童HIV组织检测定位的非侵入性方法、探测血液中无法检出的持续性病毒、发现预测病毒反弹或扩散的生物标志物，以及为HIV成人与儿科患者的临床管理提供信息。

**1.2 Marie-Claire Gauduin：新生儿猕猴模型研究儿科HIV与结核病：意义与挑战**

**1.2.1 SIV感染新生儿猕猴的早期病毒血症**

Gauduin博士首先介绍了新英格兰国家灵长类动物研究中心（NEPRC）利用新生儿恒河猴HIV感染模型的研究成果。流行病学数据显示，未经治疗婴儿中10%–25%于2年内进展为AIDS，5年内可达50%。研究考察了SIV特异性CD8⁺ T淋巴细胞功能缺陷是否导致新生儿病毒控制不良。与成人不同，婴儿在感染早期极少产生有效的病毒特异性细胞免疫应答。关于婴儿CD8⁺ T细胞应答的幅度、组织分布及功能容量（包括施加免疫压力及选择逃逸突变的能力）数据有限，这些因素可能促成了儿童AIDS的加速病程。研究中，出生2天、Mamu-B08和Mamu-B17阴性但表达Mamu-A*01的新生儿恒河猴，分别经静脉接种致病性SIVmac239（5 ng，相当于10⁴ TCID₅₀）或减毒活SIVmac239ΔV1–V2株（5 ng，相当于10⁴ TCID₅₀，缺失V1和V2高变区）。同龄未感染新生儿作为对照，于14和28日龄时进行比较。动物于感染后第14或28天尸检，对新鲜分离的血浆及血液、脾脏、淋巴结（肠系膜、腹股沟、腋窝）和胃肠道组织（空肠和结肠）的T淋巴细胞进行分析。

致病性SIVmac239感染导致显著的病毒复制爆发，血浆病毒血症于感染后7–10天达峰，最高达9.6 × 10⁷ RNA copies/mL（平均峰值4.9 × 10⁷ copies/mL）。相比之下，减毒活SIVmac239ΔV1–V2感染新生儿的病毒复制显著降低，峰值病毒血症下降3–4个数量级（第14天平均约5.9 log copies/mL），随后稳步下降至第28天接近检测不到的水平。这些数据揭示了新生儿猕猴中致病性与减毒SIV感染早期动力学特征的显著差异。

**1.2.2 新生儿恒河猴早期SIV特异性CD8⁺ T细胞应答**

采用Mamu-A*01/Gag_181–189四聚体染色定量SIV特异性CD8⁺ T细胞。SIVmac239感染新生儿中，外周血于感染后第10天可检测到四聚体阳性CD8⁺ T细胞（平均占CD8⁺ T细胞0.43%），第14天达峰（1.12%），第28天轻度下降（0.88%）。组织分析显示脾脏和结肠中Gag特异性CD8⁺ T细胞频率高于血液，提示早期抗病毒应答的组织区室化。Mamu-A*01⁺减毒SIVmac239ΔV1–V2株感染新生儿产生的SIV特异性CD8⁺ T细胞应答强于致病性SIVmac239感染者。感染后第14天，血液中四聚体阳性CD8⁺ T细胞平均达2.15%，空肠组织达2.50%。这些发现表明新生儿猕猴在急性感染期间能够产生可测量的病毒特异性CD8⁺ T细胞应答，尤其在病毒负荷降低条件下。

综合结果表明，尽管新生儿感染早期可产生SIV特异性CD8⁺ T细胞应答，但其幅度显著低于青少年或成年动物。减毒SIV感染揭示了新生儿CD8⁺ T细胞扩增增强的潜力，提示儿童HIV中有限的早期免疫控制更多源于定量和功能性限制，而非绝对无应答能力。早期CD8⁺ T细胞扩增受损可能促进婴儿期病毒控制不良和快速疾病进展，而SIV特异性应答的持续性则凸显了生命早期进行免疫干预的潜力。

研究结果突出了儿童HIV致病机制的核心主题：生命早期免疫应答在量和功能上均受限、高度组织区室化，且不足以快速控制病原体复制。这些特征同样适用于儿童结核病（TB）——与HIV类似，TB同样 disproportionately 影响婴幼儿，并与从感染到严重播散性疾病的快速进展相关。Mycobacterium tuberculosis（Mtb）感染婴儿较成人有更高的原发性进展性TB、粟粒性疾病及结核性脑膜炎发生率，提示生命早期在黏膜和系统水平的免疫控制存在根本性差异。儿童TB诊断尤为困难，临床标本中Mtb分离极为困难，且疾病表现常隐匿并可快速进展为活动性疾病。除人类外无Mtb自然宿主，目前小鼠、豚鼠、兔及非人灵长类等多种动物模型用于疫苗开发和候选药物测试。尽管成本较高，非人灵长类因基因组、生理学及免疫学与人高度相似而常被用于感染性疾病研究。恒河猴（Macaca mulatta）对TB易感，食蟹猴（Macaca fascicularis）抗性较强，但两物种的临床和病理Mtb表现非常相似，包括肺肉芽肿伴钙化、干酪样坏死、空洞形成及气管支气管淋巴结感染，可模拟人类TB所有病理特征。

**1.2.3 新生儿猕猴结核病模型的建立**

新生儿恒河猴模型为研究这些年龄依赖性易感性提供了独特平台，与其在儿科HIV感染模型中的固有价值相辅相成。Hessell博士随后介绍了西南国家灵长类动物研究中心（SNPRC）利用新生儿恒河猴Mtb感染模型的研究成果。Gauduin博士成功建立了模拟人类新生儿/婴儿Mtb感染临床和细菌学特征的气溶胶新生儿/婴儿模型，比较了气溶胶与支气管肺泡Mtb感染途径，该模型将用于建立儿童AIDS的TB共感染模型。

研究采用SNPRC的SIV阴性且D型逆转录病毒自由 colony 的印度起源恒河猴（M. mulatta）。所有新生儿均按《实验动物护理与使用指南》及美国实验动物护理认证协会标准饲养管理。未感染新生儿在SNPRC饲养5周后转入ABSL-3设施。6–7周龄动物经支气管肺泡或气溶胶途径接种Mtb Erdman（ATCC#35801）。Mtb Erdman储液采用McFarland 1.0浊度标准进行连续稀释，终浓度为1 × 10³ CFU/mL。两途径并行使用以确定模拟母婴Mtb传播的最低剂量。气溶胶感染采用专为新生儿/婴儿猕猴鼻部改造的beetle neb compact超声雾化器（流速0.5 mL/min）将接种物雾化。为建立反映人类新生儿/婴儿疾病临床和细菌学特征的新生灵长类Mtb感染模型，新生儿猕猴分别以低剂量（5 CFU）、中剂量（10 CFU）或高剂量（50 CFU）Mtb Erdman感染。

动物每日监测TB相关临床症状。于感染前及每2周采集胸片（SP VET 3.2；Xograph Imaging Systems Ltd.）、血液样本及支气管肺泡灌洗液（BAL），并于感染后12周尸检。

直接支气管镜给予低剂量（5 CFU）Mtb Erdman于感染后第42天形成离散结节，第28天未见但第42天AP位胸片清晰可见，第56天影像学消退。中剂量（10 CFU）气溶胶感染于第28天胸片见右上肺叶病变，第42天更明显但第56天开始消退。高剂量（50 CFU）气溶胶感染胸片显示左下肺叶基线不存在的小浸润灶，第42天消退。总体而言，直接支气管给予低剂量（5 CFU）Mtb Erdman于感染后第42天形成AP胸片可见的离散结节，与婴儿Mtb感染相似。

病变出现时间具有重要意义，因已知Mtb感染后初始潜伏期可达2–6周，之后才出现获得性免疫证据（如婴儿结核菌素皮试阳性）。这些一过性肺病变源于感染后巨噬细胞摄取部位Mtb的局灶复制，在人类婴儿中称为Ghon灶。所有动物胸片于感染后第28至56天可见病变，第42天最为明显。总体而言，气溶胶感染新生儿的胸片病变较支气管肺泡途径者更为弥散。

肺和胸淋巴结还观察到与早期Mtb感染一致的组织学改变。尽管新生儿猕猴观察不足3个月且无可见临床症状，但检测到了早期Mtb特异性细胞免疫应答。所有临床、影像、实验室及组织病理学发现综合符合早期TB诊断。感染后3–5周内检测到Mtb特异性免疫应答，提示新生儿可于感染后28天即产生免疫应答，与早期TB建立相关。

对PBMC及尸检收集的各种组织/器官进行IFN-γ和IL-12的ELISPOT检测以监测细胞应答随时间变化。所有Mtb感染猕猴均检测到Mtb特异性IFN-γ和IL-12免疫应答。这些结果证明新生儿猕猴可产生真正类人的早期感染特征：无临床症状但存在抗原特异性免疫应答（通过IFN-γ和IL-12释放试验检测）。

新生儿猕猴的Mtb感染与人类新生儿/婴儿的Mtb感染高度相似。新生儿猕猴为理解早期免疫应答、深入洞察儿童TB免疫致病机制、以及研究联合治疗方案和疫苗策略的有效性与安全性提供了独特机会。

**1.3 Francois Villinger：利用成像能力优化非人灵长类动物研究方法**

非人灵长类动物提供了最佳的人类HIV感染模型，得益于大量猿猴及猿猴/人免疫缺陷病毒（SIV和SHIV）分离株的可获得性，这些病毒不仅能感染多种非人灵长类，还能在更短时间内再现HIV感染人类的各种致病阶段，从而精确评估感染预防策略、表征致病机制并测试治愈策略。然而，非人灵长类供应有限且使用成本高昂，因此优化分析能力以充分开发这一宝贵模型、减少使用数量并遵循3R原则仍是优先事项。此外，儿科非人灵长类模型还存在采样受限及研究发育中生物体的特殊挑战，但这些模型能够解决至今仍有待解决的关键临床问题。Villinger博士的报告展示了用于全身病理生理过程纵向 interrogation 的创新技术。

**1.3.1 体内追踪病毒感染及储存库**

Villinger团队开发了最初用于全身体扫描中病毒信号 mapping 的方法，旨在实现高灵敏度、高特异性且非侵入性，并着眼于临床转化。考虑到物流便利性，选择正电子发射断层扫描联合计算机断层扫描（PET/CT），因全身体扫描可在30分钟内完成，使用临床或专用非人灵长类扫描仪均可。为检测SIV感染，研究团队测试并筛选了能以高亲和力结合感染细胞以克服宿主抗体竞争的单克隆抗体，并进行灵长类化改造以便体内重复应用而不产生抗抗体（ADA）风险。随后测试了Cu64或Zr89的化学标记，证实其在体内稳定。进一步优化包括采用F(ab)′或F(ab)′₂以提高信噪比，尤其在脾、心等FcR丰富器官中。此外，F(ab)′或F(ab)′₂的半衰期较短，降低了重复操作中因全长抗体长半衰期导致的冷抑制风险。该策略已扩展应用于各进化支SHIV，使用灵长类化bnAbs如PGT121或J3骆驼科纳米抗体，在成年及新生恒河猴中均有应用。利用这些优化技术，研究团队能够在体追踪急性感染期间的病毒复制、ART启动后的下降、潜伏激活剂（LRA）给药后及ART中断后的增高，更重要的是观察到延长ART后仍存在残余低水平病毒周转，提示功能性储存库在ART中断后至少1周或更长时间即出现病毒信号反弹，早于血液病毒学检测。该技术还揭示了SARS-CoV-2感染的非预期部位，如生殖道。

**1.3.2 体内追踪其他生物标志物分布**

该技术已与PET引导的活检及尸检联合应用，实现对活跃复制病毒部位的快速精确定位，以便进行共聚焦、光片、电子显微镜或空间转录组学等下游表征。此外，同位素和荧光双标记探针的应用使得器官和病毒信号部位分离细胞的流式细胞术分析和分选成为可能。ImmunoPET/CT在重复操作中耐受良好，并已扩展至检测其他可用抗体探针的生物标志物（如CD4 T细胞）。

**1.3.3 PET/CT在非人灵长类中的其他应用**

该技术还用于测量胃肠外给予抗体的分布和动力学（如COVID-19恢复期IgG和单克隆抗体）、蛋白及mRNA疫苗，以及雾化递送的蛋白质等。

总之，这些技术向儿科HIV研究模型的转移非常理想，因其微创性、高灵敏度检测方法及丰富的解剖学数据，不仅可用于病毒感染的判定，还可评估疫苗、佐剂、治疗剂等。