抗抑郁药物氯米帕明(Clomipramine)抑制ABC转运蛋白BmrA的活性

《ChemBioChem》：The Antidepressant Drug Clomipramine Inhibits the ABC Transporter BmrA

　　

药物摄取受上皮屏障(如肠道和血脑屏障)限制，这些屏障表达外排泵如ABC转运蛋白ABCB1(P-糖蛋白)。因此，靶向中枢神经系统的药物常需联用外排抑制剂以保证靶标结合；而某些设计用于不同分子通路的药物可能意外影响ABC转运蛋白。由于难以获得足量人源ABCB1蛋白，对其假定抑制剂的详细功能研究较为困难。来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的细菌ABC转运蛋白BmrA与ABCB1在结构和功能上具有相似性，是合理的替代模型。本研究以已知可通过未明机制降低人细胞多药耐药性的抗抑郁药氯米帕明(Clomipramine)为对象，证实氯米帕明可抑制全长BmrA及其分离核苷酸结合结构域(Nucleotide-Binding Domain, NBD)的ATP酶活性。通过结合实验和分子建模，研究人员在BmrA中鉴定出多个氯米帕明结合位点，这些位点在人ABCB1中同样保守，其中一个预测位点与ATP结合口袋重叠。结果强调了氯米帕明的潜在副作用，并凸显了当人源蛋白研究不可行时，利用BmrA等细菌模型研究新型抑制剂的价值。

论文解读：抗抑郁药氯米帕明对ABC转运蛋白BmrA的抑制作用研究（《ChemBioChem》）

一、研究背景与立项依据

ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运蛋白利用ATP水解供能跨膜转运底物，广泛存在于各生物域。人源ABCB1（又称P-糖蛋白/P-glycoprotein或MDR1）表达于血脑屏障等部位，外排异源物质从而降低中枢神经系统药物疗效，常需联用ABCB1抑制剂克服多药耐药(multidrug resistance, MDR)。然而人源ABCB1表达量低、纯化困难，难以开展充分体外功能与抑制机制研究。细菌IV型ABC转运蛋白BmrA（来自Bacillus subtilis）与ABCB1拓扑结构相似、底物谱重叠，且可通过大肠杆菌异源表达获得足量蛋白，是ABCB1的理想替代模型。氯米帕明(clomipramine)是三环类抗抑郁药，既往报道可逆转人细胞多药耐药性，提示其可能影响ABCB1，但具体作用位点和抑制机制不明。本研究以BmrA为模型，阐明氯米帕明抑制ABC转运蛋白的作用方式及结合位点。

二、主要关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：（1）从大肠杆菌BL21(DE3)/pLysE中异源表达并纯化全长BmrA（去垢剂DDM中）及孤立核苷酸结合结构域(NBD)，并使用大肠杆菌内膜囊泡(inverted inner membrane vesicles)及EPL脂质体重组系统；（2）Hoechst 33342荧光法检测囊泡中BmrA转运活性及氯米帕明抑制效果；（3）偶联ATP再生系统的紫外分光光度法检测全长BmrA及孤立NBD的ATP酶活性，并分析氯米帕明存在下的稳态动力学；（4）等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)和色氨酸内源荧光光谱法测定氯米帕明与孤立NBD的结合亲和力与化学计量比；（5）BS3交联结合SDS-PAGE分析NBD二聚化状态；（6）基于MOE软件SiteFinder模块及同源建模预测BmrA及人ABCB1上的氯米帕明可成药结合口袋。

三、研究结果

2.1 Clomipramine Inhibits the BmrA Transport Activity（氯米帕明抑制BmrA转运活性）

研究人员利用BmrA表达的大肠杆菌倒置内膜囊泡，以Hoechst 33342为荧光底物，加入MgATP启动转运后荧光下降。预先加入递增浓度氯米帕明，BmrA对H33342的移除速率近似线性下降，约100 μM时几乎无活性；半数抑制浓度(IC₅₀)约为44 μM。空白及失活突变体(K308A)对照无此抑制，证明氯米帕明确实抑制BmrA介导的底物外排转运。

2.2 Clomipramine Inhibits the BmrA ATPase Activity by a Mixed Mechanism（氯米帕明以混合机制抑制BmrA ATP酶活性）

在去垢剂胶束及EPL脂质体中，氯米帕明浓度依赖性地抑制全长BmrA ATPase活性，表观IC₅₀为163±88 μM。测定不同ATP浓度下的酶活并拟合米氏方程(Michaelis-Menten)，发现加100 μM氯米帕明后表观K_M升高而相对V_max下降，不符合单纯竞争性或非竞争性抑制——提示为混合抑制(mixed inhibition)：既与ATP竞争结合（K_M增大），又通过变构或结合其他位点降低催化效率(V_max降低)，暗示存在≥2个氯米帕明结合位点。

2.3 The Isolated NBD of BmrA Binds Clomipramine（BmrA孤立NBD结合氯米帕明）

ITC滴定显示氯米帕明与孤立NBD结合曲线呈"钩状"，符合序贯结合两位点模型，解离常数分别为K_D,1=26.3±3.6 μM和K_D,2=10.0±0.9 μM，呈弱正协同性。色氨酸内源荧光淬灭实验（NBD浓度1 μM，单体为主）得到K_D≈24 μM，与ITC中一个位点吻合，且证明氯米帕明结合于单体NBD并可影响唯一Trp413微环境。BS3交联实验表明氯米帕明可轻度稳定NBD二聚体，但结合不依赖于二聚化。

2.4 The Isolated NBD of BmrA Is Catalytically Active and Inhibited by Clomipramine（孤立NBD具ATP酶活性且被氯米帕明抑制）

高浓度孤立NBD表现ATP水解活性，活性随蛋白浓度非线性上升符合二聚体依赖水解特征，估算表现二聚常数~600 μM，50 μM NBD时约10%–20%为二聚体。氯米帕明浓度依赖性抑制孤立NBD ATP酶活性，校正结合消耗游离抑制剂后得抑制常数K_I=54±12 μM，证明氯米帕明可直接作用于NBD抑制其ATP水解。

2.5 Predicted Druggable Sites on BmrA（BmrA上预测的氯米帕明可成药结合位点）

SiteFinder分析多种BmrA/NBD结构得出：①孤立单体NBD高分位点（绿色球）邻近Trp413及ABC特征序列，与人ABCB1中保守，但在全长蛋白开构象中与另一单体偶联螺旋CH2冲突故生理不可及；②全长BmrA开构象中新预测位点（品红球）位于偶联螺旋CH1结合沟附近，需CH1参与才形成强作用；③NBD二聚体（闭构象）中预测位点重叠于ATP结合口袋（深蓝球），另有二聚界面中心位点（浅蓝球）。上述NBD位点在人ABCB1同源结构中亦保守。表明氯米帕明可结合NBD上多个位点，其中ATP位点结合产生竞争性抑制，CH1沟结合可能阻碍构象转换。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出，氯米帕明结合BmrA并抑制其ATPase及转运活性，抑制常数与ITC/荧光结合K_D一致（数十μM）。动力学呈混合抑制模式源于多结合位点：其一重叠ATP结合口袋产生竞争性成分；其二位于CH1偶联螺旋沟（全长蛋白特有），结合后可干扰NBD-TMD偶联及构象循环，造成非竞争性成分。孤立NBD上两结合位点（近Trp413及拟ATP位点）呈弱协同。因临床血药浓度（<1 μM）低于体外IC₅₀，常规给药时广谱ABC转运蛋白抑制临床意义有限，但提示其逆转MDR潜力及脱靶效应风险。偶联螺旋沟(CH1 groove)在不同ABC转运蛋白间特异性高于高度保守ATP口袋，是更具选择性的抑制靶点。BmrA可作为人ABCB1替代模型用于初筛及机制解析。

结论翻译：本研究表明抗抑郁药氯米帕明(clomipramine)结合ABC转运蛋白BmrA的核苷酸结合结构域(NBD)，抑制其ATP酶活性及底物转运功能；在BmrA（及人同源ABCB1）上鉴定出多个氯米帕明结合位点，包括重叠ATP结合口袋的位点及全长蛋白中偶联螺旋CH1结合沟处的位点。抑制呈混合机制，部分由与ATP竞争所致，部分由干扰构象循环所致。鉴于所鉴定位点在人ABCB1中保守，氯米帕明可作为广义ABC转运蛋白NBD抑制剂范例；结果同时凸显以细菌BmrA为模型研究人ABC转运蛋白抑制剂的机制及价值。