《Methods》：A fluorescence-based high-content imaging workflow for multi-parametric lipid droplet phenotyping via Oil Red O fluorescence
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严少军|姚玉琴|刘从英|朱慧|吴晓燕|刘春明|杨洋上海中医药大学科学技术实验中心，中国上海201203摘要代谢相关性脂肪肝病（MAFLD）的进展涉及肝内脂滴（LDs）的过度积累。然而，目前仍难以实现低成本、高通量的成像技术，以在单细胞水平上进行详细的多参数脂滴量化。材料与方法在这
严少军|姚玉琴|刘从英|朱慧|吴晓燕|刘春明|杨洋
上海中医药大学科学技术实验中心，中国上海201203
摘要
代谢相关性脂肪肝病（MAFLD）的进展涉及肝内脂滴（LDs）的过度积累。然而，目前仍难以实现低成本、高通量的成像技术，以在单细胞水平上进行详细的多参数脂滴量化。
材料与方法
在这里，我们建立了一个高内涵筛选（HCS）平台，该平台利用Oil Red O（ORO）的荧光特性来量化脂滴表型。这种方法能够同时提取游离脂肪酸（FFA）诱导的AML12肝细胞中的多参数形态特征，包括脂滴数量、大小、强度和空间分布。作为概念验证，我们系统地筛选并验证了来自文献的36种降脂化合物。
结果
基于ORO荧光的HCS平台显示出足够的灵敏度、低背景干扰以及单细胞量化的空间分辨率，优于明场分析。数据聚类将单体化合物分为不同的脂质调节模式。例如，五环三萜类化合物减少了脂滴的数量和大小，而二萜醌类化合物降低了脂滴密度。
结论
本研究建立了一种可靠、可视化且经济的高内涵筛选方法，用于评估脂滴动态。通过将多维成像指标与特定的细胞表型相关联，该平台为评估脂毒性以及从天然产物库中高通量发现抗脂肪肝药物候选物提供了实用的方法。
引言
代谢相关性脂肪肝病（MAFLD）已取代了传统的非酒精性脂肪肝病（NAFLD），成为全球最常见的慢性肝病[1]。据估计，全球超过三分之一的人口患有MAFLD[2]。MAFLD的发展过程从单纯的脂肪变性发展为代谢相关性脂肪性肝炎（MASH），其特征是肝细胞损伤和炎症，并且与纤维化、肝硬化和肝细胞癌的高风险相关[3]。MAFLD的病理进展涉及“多重并行打击”机制[4]，其中肝细胞中脂滴的异常积累是关键诱因，导致脂毒性[5]、氧化应激和炎症反应[6][7]。脂滴表型可以通过其数量、大小和分布来表征。当代谢负荷破坏调控脂滴生成、融合和降解的机制时，异常的细胞内脂滴表型（如肥大、增殖或异常分布）成为脂毒性的形态学标志[8][9]。脂滴的积累是MAFLD的关键病理特征[10]。因此，调节脂滴表型已成为MAFLD药物发现中的关键策略。
尽管脂滴动态在MAFLD中起着核心作用，但这些表型的精确量化在方法学上仍然具有挑战性。传统的生化检测仅提供组织平均值，掩盖了关键的单细胞异质性。虽然经典的明场成像技术可以观察到Oil Red O（ORO）染色下的脂质积累，但其主要是定性的、低通量的，并且容易受到背景干扰，不适合自动化量化。相反，尽管亲脂性荧光探针具有高灵敏度，但它们在大规模高内涵筛选（HCS）中的应用往往受到高成本和光漂白的限制[11][12]。因此，开发一种低成本、高通量的成像和分析方法，能够量化多参数脂滴表型，具有重要的方法学价值。
HCS系统在基于表型的药物发现中的科学有效性和实用性。表型形态分析具有独特的优势，包括高通量、多参数性和可视化能力，允许在单细胞水平上同时获取形态学、生化和功能信息。得益于高内涵、高通量的图像采集和成熟的图像分析算法，表型信息已从定性观察发展为适合统计分析的定量研究[13]。此外，使用基于U-Net和Transformer的AI技术进一步增强了定量质量和维度。此外，我们发现ORO这种经典的脂质染色剂具有内在的、高度稳定的荧光特性。这一特性为实现高特异性、低背景和低成本的脂滴定量检测提供了坚实的技术基础。
基于这一原理，本研究旨在建立一种渐进的、经济高效的HCS分析工作流程，利用ORO荧光来量化脂滴表型。为了验证该方法的可靠性和分析能力，我们使用文献中的36种脂质调节化合物进行了概念验证筛选。通过量化多表型特征（包括脂滴数量、大小、强度和分布），并结合多维聚类分析，本研究为基于表型的药物发现和细胞脂毒性分析提供了一个可视化的技术平台。
章节片段
试剂
油酸（OA）和棕榈酸（PA）购自中国上海的中药化学试剂有限公司（Sinopharm Chemical Reagent Co, Ltd）。Dulbecco改良Eagle培养基/nutrient混合物F-12（DMEM/F-12）、胎牛血清（FBS）、胰岛素-转铁蛋白-钠（ITS）、青霉素-链霉素、地塞米松和磷酸盐缓冲盐水（PBS）购自上海美仑生物科技有限公司（Meilun Biotechnology Co, Ltd）。无脂肪酸的牛血清白蛋白（fatty acid-free BSA）购自Yeasen
ORO的荧光特性及其在脂滴标记中的应用
ORO是一种常用的脂质标记染料，长期以来一直用于观察细胞或组织中的脂质浸润。我们发现ORO具有荧光特性，可用于定性检测（图1A）。此外，其低背景荧光信号使得ORO适用于图像量化。通过微孔板读取器的步进扫描，我们确认ORO的激发波长为628 nm，发射波长为684 nm（图
讨论
虽然肝细胞内脂滴的异常积累是驱动MAFLD发生的关键病理特征，但这种表型的精确量化仍然是药理学评估的关键瓶颈[16][17]。传统的筛选方法通常依赖于低通量的比色测定或主观的显微镜评分，这些方法可能无法反映单细胞异质性和多维分辨率。为了解决这个问题，采用亲脂性荧光技术的高内涵成像技术
资助
本工作得到了国家自然科学基金（编号82374109）和上海中医药大学预算资金（自然科学）（资助编号23KFL024）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
