通过 circular RNA 分析发现的一种新型环状 RNA circPRIM2 可抑制奶牛乳腺炎中的乳腺上皮细胞增殖和免疫反应

《Microbial Pathogenesis》：A novel circular RNA circPRIM2 revealed by circular RNA profile inhibits mammary epithelial cell proliferation and immune response in bovine mastitis

　　

魏阳|贾同国|景高|牛一晨|董新楠|罗成华|谢小刚|李丹|高明青

中国西安西北大学医学院，邮编710069

摘要

背景

牛乳腺炎是一种主要的炎症性疾病，会损害乳腺上皮功能、牛奶产量和动物健康。环状RNA（circRNAs）参与许多生理和病理过程，但它们在病原体诱导的牛乳腺上皮功能障碍中的作用仍不清楚。目的：本研究旨在识别与乳腺炎相关的circRNAs，并确定circPRIM2是否调节乳腺上皮细胞增殖、β-酪蛋白分泌和炎症反应。

方法

通过热灭活的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或大肠杆菌（Escherichia coli）刺激，在牛乳腺泡细胞-T（MAC-T）细胞中建立了炎症模型。通过高通量测序和生物信息学预测分析circRNA谱型。进一步通过RNase R消化、RT-qPCR、CCK-8、EdU、Western blot和ELISA实验验证了circPRIM2的稳定性和功能。

结果

在金黄色葡萄球菌处理的MAC-T细胞中共鉴定出5043个circRNAs，其中31个circRNAs在金黄色葡萄球菌处理组和对照组细胞之间存在差异表达。circPRIM2是一种源自PRIM2基因座的新型circRNA，在炎症条件下表达下调，并且对RNase R消化具有抗性。circPRIM2过表达降低了MAC-T细胞的存活率和EdU掺入量，增加了β-酪蛋白的表达和分泌，同时减少了LTA诱导的TNF-α和IL-1β的分泌以及p65的磷酸化。

结论

这些发现表明，circPRIM2可能作为一种上皮调节circRNA，在牛乳腺炎期间连接细胞生长、分泌功能和免疫反应。本研究为进一步探索circPRIM2作为乳腺炎管理的潜在生物标志物或分子靶点提供了基础。

引言

牛乳腺炎是一种常见的病理过程，是牛的主要临床疾病[1]。乳腺炎病原体已被分类为多种类型[2]。特别是那些能够适应并在宿主体内存活的传染性病原体被认为是主要致病因子。当病原体突破宿主的防御屏障时，通常会导致牛乳腺的持续性感染，从而给乳制品行业带来经济损失，并对公共卫生产生重大影响[3]。然而，抗生素仍然是治疗牛乳腺炎的主要大规模选择。由于抗生素使用的限制，新的治疗靶点需求日益增加。近年来，作为基因表达调节因子的非编码RNA已成为研究的热点，以开发治疗牛乳腺炎的新策略[4]。

乳腺炎也是理解病原体引发的乳腺上皮损伤的有用模型，因为宿主-病原体相互作用在不同细菌种类、宿主组织和疾病背景下可能有所不同。因此，阐明不同宿主体内的发病机制对于识别保守的炎症途径和宿主特异性调节因子非常重要。最近的生物医学研究已从传统的二维细胞培养转向3D类器官和器官芯片模型，用于疾病建模和治疗测试[5]。同时，基于纳米技术的抗群体感应配方正在扩展，以针对微生物毒力和生物膜相关的致病性[6]，[7]。宿主-微生物组相互作用和微生物失调也被强调为不同器官系统中炎症性疾病的重要驱动因素[8]。这些进展突显了识别控制牛乳腺炎中上皮炎症和组织功能的内源性分子调节因子的必要性。

在过去的几十年中，越来越多的非编码RNA（ncRNA）种类在真核细胞中被发现[9]。越来越多的证据表明，ncRNA与炎症密切相关，如炎症性肠病[10]、胃炎[11]和类风湿性关节炎[3]。多年来，环状RNA（circRNAs）被认为是RNA剪接的副产物，因为它们的表达水平较低[12]。有报告指出，circRNAs广泛存在，可能代表一类独特的RNA[13]。circRNAs通常通过前mRNA的反剪接形成，其3′和5′末端通过共价键连接[14]。一般来说，circRNAs充当miRNA的“海绵”，在各种生物过程中发挥重要作用[15]。它们还可以调节其母基因的表达[16]。circRNAs的表达受到发育调控，特定circRNA的功能在不同动物物种中是保守的[17]。研究人员发现，一些circRNAs在炎症性疾病中发挥特殊的调节作用，如骨关节炎[18]和非酒精性脂肪性肝炎[19]。此外，它们还被发现会影响食管鳞状细胞癌等条件下的癌细胞增殖[20]。然而，在兽医科学领域，只有少数circRNAs被研究过。

在这项研究中，我们筛选并鉴定了用金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）处理的乳腺上皮细胞中的circRNAs，发现一种位于PRIM2基因座的新circRNA（命名为circPRIM2）在炎症条件下调节牛上皮细胞增殖、β-酪蛋白分泌和免疫反应中起作用。本研究的结果表明circRNAs可能在调节牛乳腺炎中发挥作用，它们有可能成为circRNA疫苗、治疗药物或佐剂开发的新平台[21]。

基于这些观察结果，我们假设病原体诱导的circRNA表达变化会导致牛乳腺炎期间的乳腺上皮功能障碍。本研究的合理性在于circRNAs是稳定的调节分子，可能将病原体刺激与上皮增殖、分泌活动和免疫信号传导联系起来。我们工作的新颖之处在于从circRNA谱型中鉴定出一个先前未被表征的circRNA circPRIM2，并对其在MAC-T细胞中的功能进行了验证。了解circPRIM2可能有助于阐明乳腺上皮细胞如何平衡组织修复、乳蛋白分泌和炎症，这可能为未来的乳腺炎监测或干预提供一个潜在的分子切入点。

章节片段

非生物细菌的制备

金黄色葡萄球菌（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和大肠杆菌（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）分别在Luria-Bertani（LB）培养基中培养至对数生长阶段，培养温度为42°C。金黄色葡萄球菌在65°C下灭活1小时，大肠杆菌在63°C下灭活2小时。将灭活后的细菌接种到不含抗生素的LB平板上，培养约12小时，以确保在孵育后没有观察到细菌菌落，从而验证它们已被完全灭活。

牛正常和炎症上皮细胞中circRNAs的谱型分析

首先，通过用非生物性的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌处理MAC-T细胞，成功建立了乳腺炎的炎症细胞模型，表现为白细胞介素（IL）-6、IL-8和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达升高（补充图S1）。然后，从正常和炎症MAC-T细胞中提取总RNA作为测序样本。在未经RNase R处理的总RNA序列数据中检测和表征了circRNAs。总共检测到1974、3382和5043个circRNAs

讨论

大多数研究牛乳腺炎的分子机制的研究主要集中在蛋白质编码基因的作用上。因此，使用RNA测序方法的研究通常集中在mRNAs上。然而，circRNAs在牛乳腺炎中的潜在功能仍不清楚。我们目前的研究表征了在炎症条件下牛上皮细胞中circRNAs的表达谱型。此外，我们还研究了特定circRNA在介导中的作用

结论

总之，本研究分析了炎症条件下牛乳腺上皮细胞中的circRNAs，并鉴定出一种源自PRIM2基因座的新下调circRNA circPRIM2。功能实验表明，circPRIM2过表达抑制了MAC-T细胞的增殖，促进了β-酪蛋白的表达和分泌，减少了LTA诱导的炎症细胞因子的产生和p65的磷酸化。这些发现表明circPRIM2可能参与调节

CRediT作者贡献声明

高明青：撰写 – 审稿与编辑。魏阳：可视化。贾同国：研究。景高：数据管理。牛一晨：研究。董新楠：数据管理。罗成华：数据管理。谢小刚：研究。李丹：研究

利益声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

资助

本研究得到了陕西省重点研发计划（编号2019NY-088）的资助。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。