针对严重发热伴血小板减少综合征病毒的多表位疫苗候选物的计算设计与体外验证

《Microbial Pathogenesis》：Computational Design and In vitro Validation of a Multiepitope Vaccine Candidate Against Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus

　　

余子辉|王佳欣|唐志杰|赵海

首都医科大学儿童健康中心细菌学系，首都儿科研究所，北京100020，中国

摘要

严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）是一种新出现的蜱传病原体，具有高死亡率，且目前尚无批准的疫苗或特定的抗病毒疗法。本研究旨在利用整合免疫信息学和体外实验方法，设计并验证一种针对SFTSV膜糖蛋白的多表位疫苗候选物。通过免疫信息学工具筛选出具有高抗原性、强HLA结合亲和力、无过敏性和无毒性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和辅助T淋巴细胞（HTL）表位。选定的表位被组装成多表位疫苗构建体，其中加入人β-防御素-3作为佐剂，PADRE序列以增强辅助T细胞反应，并使用适当的连接子来提高结构稳定性和抗原加工效率。通过结构建模、与Toll样受体4（TLR4）的分子对接、分子动力学模拟、免疫模拟和二硫键工程等方法评估了该构建体的结构稳定性和免疫原性。经过密码子优化的基因序列被克隆到pET-28a(+)载体中，在大肠杆菌中表达，并通过Ni-NTA亲和层析法纯化。实验结果表明，重组蛋白具有约21.8 kDa的分子量，纯度高且抗原反应性强。此外，纯化蛋白在哺乳动物细胞模型中表现出极低的细胞毒性，并显著刺激了先天免疫信号通路、细胞因子产生和抗体反应。这些发现表明，所设计的多表位疫苗构建体在体外具有结构稳定性和免疫原性，为其在动物模型和临床前研究中对抗SFTSV感染提供了潜力。

引言

严重发热伴血小板减少综合征（SFTS）是一种由严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）引起的新兴蜱传传染病，该病毒属于Phenuiviridae科Bandavirus属[1]。自2009年在中国首次发现以来，SFTSV迅速传播至东亚地区，包括日本和韩国，最近还扩散到东南亚部分地区，对全球公共卫生构成了严重威胁[2, 3, 4]。该疾病的特点是高热、胃肠道症状、血小板减少、白细胞减少和多器官衰竭，常导致严重的出血并发症[5]。SFTSV被认为是一种高度致命的新发布尼亚病毒，其临床表现严重，包括细胞因子失调和多器官功能障碍，死亡率在10%至30%之间，尤其是在老年人和免疫功能低下的人群中[6, 7]。近年来，SFTSV感染在流行地区的发病率和地理分布不断增加，引发了重大的公共卫生问题[8, 9]。目前尚无针对SFTSV感染的许可疫苗或特定抗病毒疗法，因此迫切需要开发有效且安全的疫苗候选物[10]。尽管SFTSV具有通过Haemaphysalis longicornis蜱虫和动物宿主传播的潜力，但缺乏有效的预防和治疗策略，这突显了合理疫苗开发方法的紧迫性[10]。

SFTSV是一种包膜负链RNA病毒，其基因组由大段（L）、中段（M）和小段（S）组成，分别编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）、糖蛋白（Gn和Gc）、核蛋白（NP）和非结构蛋白（NSs）[11]。表面糖蛋白Gn和Gc介导病毒附着、融合和进入宿主细胞，使其成为疫苗开发的重要免疫原靶点[12]。NSs蛋白作为强效干扰素拮抗剂，有助于病毒逃避免疫系统并促进病毒致病性，而NP则参与基因组包装和复制[13]。这些结构蛋白和非结构蛋白共同促进了病毒复制并调节宿主免疫反应，给传统疫苗开发策略带来了挑战[14]。传统的疫苗方法（如灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗）由于安全性问题、免疫原性不足和制造限制而效果有限[15]。

免疫信息学是一门结合计算生物学、结构免疫学和疫苗学的跨学科领域，近年来显著推动了疫苗设计策略的发展[16]。这种方法有助于识别能够引发强烈体液和细胞介导免疫反应的抗原决定簇（表位），同时克服了经验性疫苗开发方法的局限性[17]。多表位疫苗（MEV）设计将选定的CTL、HTL和B细胞表位整合到一个构建体中，以扩大免疫原性并降低过敏性[18]。最近的免疫信息学驱动研究已成功应用于Chandipura病毒的多表位疫苗设计，显示出良好的抗原性和免疫原性[19]。先进的计算机模拟工具现在可以准确预测表位与主要组织相容性复合体（MHC）分子的结合，评估抗原性并评估人群覆盖率，从而加速疫苗开发[20]。此外，这种策略有助于合理选择能够诱导平衡Th1和Th2免疫反应、促进记忆T细胞形成和产生持久中和抗体的表位[21]。

在本研究中，采用整合免疫信息学方法设计了针对SFTSV的广谱多表位疫苗候选物。该方法包括检索病毒蛋白序列、预测和选择高抗原性和无过敏性的表位，以及使用合适的佐剂和连接子组装优化后的疫苗构建体。通过结构建模、与Toll样受体（TLRs）等免疫受体的分子对接、分子动力学模拟、免疫模拟和二硫键工程等方法评估了疫苗构建体的结构稳定性和免疫原性。此外，还进行了密码子优化和计算机克隆，以在合适的宿主表达系统中实现高效表达。

部分摘录

蛋白质检索

从UniProt数据库中检索到了严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）的膜糖蛋白的氨基酸序列（登录号：F9YR56）（https://www.uniprot.org/）。选择该蛋白序列是因为其在病毒附着、融合和宿主细胞进入中的作用，使其成为疫苗开发的合适靶点。使用VaxiJen v3.0服务器评估了该蛋白的抗原性，以确定其作为疫苗的适用性

蛋白质检索

从UniProt数据库中检索到了严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）的膜糖蛋白的氨基酸序列（登录号：F9YR56），用于后续的免疫信息学分析。这种糖蛋白在病毒附着、膜融合和宿主细胞进入中起关键作用，是免疫识别和中和的重要抗原靶点。使用VaxiJen v3.0服务器进行的抗原性分析表明

细胞相容性和细胞毒性评估

细胞相容性分析显示，重组多表位疫苗蛋白对免疫反应细胞模型的细胞毒性极低。未经处理的对照细胞存活率为100 ± 3.8%，而用1 μg/mL浓度的重组疫苗蛋白处理后细胞存活率为97.2 ± 2.6%，5 μg/mL浓度处理后为95.4 ± 3.1%。这些值与未处理组无显著差异

讨论

本研究描述了利用整合免疫信息学和实验方法设计和初步验证针对严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）的多表位疫苗候选物的过程。首先采用了全面的计算机模拟工作流程，包括抗原选择、表位预测、疫苗构建体设计、结构建模、分子对接、分子动力学模拟、免疫模拟和密码子优化

结论

本研究提出了基于整合免疫信息学的多表位疫苗候选物的设计及初步实验验证。计算分析帮助识别和组装了高抗原性的CTL和HTL表位，能够刺激细胞和体液免疫反应，并提供广泛的人群覆盖范围。结构建模、二硫键工程、分子对接等手段进一步优化了疫苗性能

作者贡献声明

余子辉：研究、数据分析、概念化。王佳欣：监督、软件使用、项目管理、方法学。唐志杰：写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督、软件使用。赵海：可视化、验证、监督、软件使用、方法学

数据可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在论文中。

伦理考虑

本研究未涉及人类参与者或动物。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

作者声明没有财务或非财务上的利益冲突。作者没有可能影响本文工作的相关隶属关系、财务关系或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：32400158）、首都儿科研究所基础研究项目（资助编号：JCYJ-2025-02）、辽宁省应用基础研究计划（资助编号：2022JH2/101500068）以及辽宁省教育厅科研项目（资助编号：LJ212510164014）的支持。