伊维菌素(ivermectin)对人GABAA受体激活与脱敏(desensitization)的影响

《Molecular Pharmacology》：Effects of ivermectin on the activation and desensitization of the human GABAA receptor

　　

伊维菌素(ivermectin)是一种广泛使用的抗寄生虫药物，其通过变构(allosteric)激活及增强线虫和昆虫神经元与肌细胞上谷氨酸门控氯离子通道(glutamate-gated chloride channel, GluCl)发挥作用。在哺乳动物中，伊维菌素可激活半胱氨酸环配体门控离子通道(Cys-loop ion channel)家族的多个成员，包括γ-氨基丁酸A型受体(GABAAreceptor)。虽然中枢GABAA受体因血脑屏障(blood-brain barrier)上P-糖蛋白1(P-glycoprotein 1)的外排作用而免受伊维菌素影响，但大量外周(peripheral)GABAA受体可暴露于血循环中的伊维菌素。本研究探讨了伊维菌素对表达于非洲爪蟾(Xenopus)卵母细胞中的α5β3γ2L与α1β3γ2L亚型GABAA受体的激活及调节作用。研究人员发现伊维菌素是α5β3γ2L受体强效且有活性的(full-efficacy)激动剂(agonist)，半数有效浓度(EC50)为0.06 μM，最大激活态概率(probability of being in the active state, PA)＞0.3。与典型GABAA受体激动剂不同，即使持续应用20分钟，伊维菌素亦不引起受体脱敏(desensitization)。经高浓度γ-氨基丁酸(GABA)致脱敏的受体在暴露于伊维菌素后可被重新激活(re-activated)。伊维菌素与GABA或别构激动剂依托咪酯(etomidate)共应用时，表现为各自反应的简单相加(additivity)而非增强(potentiation)。另一别构激动剂戊巴比妥(pentobarbital)与伊维菌素共应用时对伊维菌素反应无影响或使其减弱。综上，伊维菌素对GABAA受体的激活表现出常用或已研究的GABA能药物所不具备的若干独特性质。

论文解读：伊维菌素对人GABA_A受体激活与脱敏的影响

一、研究背景与目的

伊维菌素（ivermectin）作为抗寄生虫药主要通过激活无脊椎动物的谷氨酸门控氯离子通道（GluCl）起效。在哺乳动物中，伊维菌素可作用于半胱氨酸环配体门控离子通道家族（Cys-loop ion channel family），包括烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic receptor）、甘氨酸受体（glycine receptor）及GABA_A受体（GABA_AR）。由于血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）上P-糖蛋白1（P-glycoprotein 1, P-gp）的外排作用，中枢GABA_AR通常不受伊维菌素影响，但外周（peripheral）组织如背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）、胰岛β细胞、T淋巴细胞、肾脏及肝脏中表达的GABA_AR均可被血中伊维菌素作用。既往文献关于伊维菌素对GABA_AR仅具微弱正向变构调节（positive allosteric modulation）还是具直接激动活性存在矛盾，且伊维菌素近年因潜在抗肿瘤属性受到关注。因此，研究人员（Pierce SR et al., 发表于Molecular Pharmacology）旨在明确伊维菌素对人重组α5β3γ2L及α1β3γ2L亚型GABA_AR的直接激活能力、脱敏特性、对已脱敏受体的再激活能力及其与正交位点激动剂GABA、别构麻醉药（etomidate、pentobarbital、propofol）之间的能量加和性（energetic additivity）。

二、主要关键技术方法

研究人员将人α5β3γ2L、α1β3γ2L、α5β3及α1β3 GABA_AR的cRNA按特定比例显微注射入非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞（oocytes），16℃孵育后用于电生理记录。采用标准双微电极电压钳（two-electrode voltage clamp, TEVC）技术，维持钳制电位-60 mV（或行 episodic stimulation 以测电导计算开放概率），以ND96液为灌流液，重力式快速给药。通过饱和GABA（1 mM）联合丙泊酚（propofol, 50 μM）产生最大激活态概率（P_A≈1），毒蝇蕈醇拮抗剂苦味毒素（picrotoxin, PTX, 200 μM）设定P_A=0，将测试电流/电导归一化为P_A。浓度-效应关系拟合Hill方程及两态（Resting-Active）MWC共激动剂模型（Monod-Wyman-Changeux model），计算平衡解离常数（K_C）、活性态稳定化能（ΔG_agonist=-RTln c）及脱敏残余/峰值比。统计采用配对/非配对t检验。

三、研究结果

（一）Functional properties of the α5β3γ2L GABA_Areceptor（α5β3γ2L GABA_A受体的功能特征）

研究人员测定该亚型本底组成型活性（constitutive activity）P_A,const=0.0046±0.0029。GABA浓度-效应曲线得EC₅₀=4.4±1.6 μM，最大P_A,GABA=0.94±0.03，Hill系数n_H=1.48±0.13。MWC模型拟合得GABA结合平衡解离常数K_C,GABA=14.3±3.7 μM，c_GABA=0.013±0.003，两个GABA分子结合提供约-5.0±0.1 kcal/mol的门控能（gating energy）。

（二）Ivermectin activates the α5β3γ2L GABA_Areceptor（伊维菌素激活α5β3γ2L GABA_A受体）

伊维菌素单独应用可浓度依赖性直接激活α5β3γ2L受体，EC₅₀=0.065±0.005 μM（65 nM），最大P_A,IVM=0.32±0.01，n_H=1.49。持续灌流0.1或1 μM伊维菌素达20分钟未观测到电流衰减（即无脱敏）。1 mM GABA引发明显脱敏（残余/峰值=0.59±0.13），共加1 μM伊维菌素后脱敏显著减弱（残余/峰值=0.88±0.07, P<0.01）。当GABA致受体进入稳态脱敏后施加1 μM伊维菌素，可使稳态电流回升至GABA峰值响应的78±7%（较原稳态提升137±26%），表明伊维菌素促进受体从脱敏态向激活态转换（desensitized-to-active transition）。即便在GABA+神经甾体3α5βP（3α5βP, pregnanolone）使P_A≈1的条件下，伊维菌素仍可进一步提升稳态响应至170±94%，佐证其再激活脱敏受体的独特机制。

（三）Lack of energetic additivity between ivermectin and orthosteric or allosteric agonists in the α5β3γ2L GABA_Areceptor（α5β3γ2L GABA_A受体中伊维菌素与正交或别构激动剂间缺乏能量加和性）

低浓度GABA（0.04 μM）单独或与0.1 μM伊维菌素共施时，计算GABA提供的门控能ΔG_GABA分别为-1.01±0.19 kcal/mol与-0.17±0.07 kcal/mol（P=0.0013），二者差异显著。同理，依托咪酯（2 μM）单独与+伊维菌素条件下ΔG_Eto分别为-0.93±0.20与-0.08±0.03 kcal/mol（P=0.0002）；戊巴比妥（100 μM）单独ΔG_PEB=-0.87±0.21 kcal/mol，而在伊维菌素背景下戊巴比妥几无附加激活甚至略降电流（ΔG_PEB=0.04±0.02 kcal/mol, P=0.0006）。以上表明伊维菌素与GABA、etomidate或pentobarbital均不表现典型的能量加和/协同增强，且伊维菌素结合改变了正交位点的表观亲和力-效能偶联。阳性对照GABA与etomidate间则符合能量加和预期。降低伊维菌素至0.01 μM（背景P_A相当低）重复GABA实验仍得ΔG_GABA在有无伊维菌素时显著不同，排除单纯因背景P_A升高导致该现象。

（四）New insights into activation and modulation of the α1β3γ2L GABA_Areceptor by ivermectin（伊维菌素对α1β3γ2L GABA_A受体激活与调节的新见解）

α1β3γ2L亚型表现与α5β3γ2L定性一致：1 mM GABA致脱敏（残余/峰值=0.57±0.13），共加1 μM伊维菌素几乎消除脱敏（残余/峰值=1.02±0.12, P<0.01）。GABA稳态脱敏后加伊维菌素使电流回升至初始GABA峰值的91±7%；在GABA+3α5βP基础上伊维菌素仍可增大约20%。GABA（0.7 μM）、etomidate（2 μM）、pentobarbital（20 μM）分别与0.1 μM伊维菌素共施时，各正交/别构激动剂提供的ΔG均较单独应用时显著减小（P均<0.001），同样证实无能量加和性，且pentobarbital在伊维菌素背景下无附加激活——可能与二者共享部分跨膜域结合界面（α(+)-β(-)及γ(+)-β(-) intersubunit interfaces）产生竞争性互作有关。

四、讨论与结论总结

研究人员指出，伊维菌素是人或哺乳动物GABA_AR的强效直接激动剂（α5β3γ2L EC₅₀≈60–65 nM），其结合位点位于跨膜域亚基间界面，作用近乎不可逆、且不诱发受体脱敏——这是区别于其他GABA_AR激动剂的突出特征。伊维菌素不仅能直接激活受体，还可通过促使受体从GABA诱导的脱敏态回到激活态（desensitized-to-active transition）来抑制/逆转脱敏，这一特性类似于α7 nAChR的II型正向变构调节剂（type II positive allosteric modulator, PAM）。尽管伊维菌素结合位点（跨膜域）与GABA正交结合位点（胞外域）物理分离，但二者未表现常规Cys-loop受体中所见的能量加和性（energetic additivity），提示伊维菌素结合破坏了正交位点亲和态与门控开启间的偶联（impairment of the link between the open activation gate and the state of the orthosteric site）。戊巴比妥与伊维菌素可能的部分重叠结合解释了前者在伊维菌素背景下无附加激活或轻微抑制。α5β3γ2L相较α1β3γ2L具更高组成型活性及稍高GABA敏感度（低EC₅₀），但伊维菌素对两亚型作用模式定性相同。人口服伊维菌素后血浆浓度可达~0.3 μM，超α5/α1β3γ2L受体EC₅₀，故外周GABA_AR可被激活并产生持续Cl^-电导改变，可能影响感觉神经元兴奋性、胰岛素分泌或免疫细胞细胞因子释放等生理过程。综上结论为：(1)伊维菌素是人GABA_AR（α1/α5β3γ2L）的强效直接激动剂（EC₅₀≈0.06–0.07 μM），最大激活概率P_A≈0.3–0.5；(2)伊维菌素不引起GABA_AR脱敏，且能再激活由高浓度GABA致脱敏的受体、减轻共应用时的脱敏程度；(3)伊维菌素与GABA、etomidate或pentobarbital之间无能量加和性，不符合典型独立别构-正交激动剂协同模型。