mGlu7/8异源二聚体的分子药理学揭示正构激动剂和正向别构调节剂的独特性质

《Molecular Pharmacology》：Molecular Pharmacology of mGlu7/8 Heterodimers Reveals Unique Properties of Orthosteric Agonists and Positive Allosteric Modulators

　　

代谢型谷氨酸（metabotropic glutamate, mGlu）受体属于C族G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors, GPCR），广泛表达于中枢神经系统，以同源二聚体或异源二聚体形式发挥功能。近期文献提示，特定的mGlu异源二聚体亚型在大脑中发挥关键功能作用，并展现出相对于同源二聚体独特的药理学特征。研究人员之前已证明，利用体外能区分mGlu7/7同源二聚体与mGlu7/8异源二聚体的负向别构调节剂（negative allosteric modulators, NAMs），mGlu7/8异源二聚体可能调节海马突触可塑性的诱导。然而，研究人员尚未在异源二聚体特异性检测中表征靶向mGlu7和mGlu8的正向别构调节剂（positive allosteric modulators, PAMs）。在此，研究人员利用受控受体活性的功能检测（在HEK293细胞中），使用PAMs和多种正构激动剂（orthosteric agonists），研究了mGlu7/8异源二聚体相对于mGlu7/7和mGlu8/8同源二聚体的分子药理学。研究人员证明，一种mGlu8选择性激动剂仅对mGlu8/8同源二聚体有活性，而在mGlu7/8异源二聚体上起拮抗剂作用。此外，研究人员发现，特定的PAMs（如VU0155094）在特定检测中对mGlu7/8异源二聚体表现出更高的效能。总体而言，这些发现对于理解mGlu异源二聚体和同源二聚体在生理和行为中的作用，以及这些化合物的药理学特性具有重要意义。此外，本研究为使用药理学工具包选择性探测天然组织中的mGlu7/7、mGlu8/8和mGlu7/8二聚体提供了理论依据。

代谢型谷氨酸（mGlu）受体属于C族G蛋白偶联受体（GPCR），广泛表达于中枢神经系统，分为三组：组I（mGlu1,5）、组II（mGlu2,3）和组III（mGlu4,6,7,8）。现有证据表明，所有mGlu受体均可形成异源二聚体，相对于同源二聚体，异源二聚体在天然组织中显著影响受体药理学和生理学。例如，mGlu2/4异源二聚体在多个脑区具有不同表达模式，并调节丘脑皮质突触的投射特异性兴奋性传递。研究人员先前证明，小鼠海马中存在一种药理学特征与mGlu7/8异源二聚体一致的受体，并调节突触可塑性。具体而言，抑制mGlu7/8异源二聚体的mGlu7负向别构调节剂（NAMs）可阻断海马Schaffer侧支至CA1（SC-CA1）突触的长时程增强（LTP）诱导，而不抑制异源二聚体的NAMs则无此作用。此外，编码mGlu7（GRM7）和mGlu8（GRM8）的基因突变和多态性与神经发育障碍（如ADHD和癫痫）相关。临床前证据表明，Grm7基因敲除（KO）小鼠出现癫痫、认知障碍和ADHD样症状，而Grm8 KO小鼠表现出焦虑和ADHD样表型。研究人员还发现，组III mGlu受体PAM VU0422288在Rett综合征小鼠模型中显示治疗效力，而mGlu7/mGlu8选择性PAM VU6005649增强野生型小鼠的联想学习。然而，多种组III正构激动剂和PAMs在mGlu7/8异源二聚体上的分子药理学尚未被充分研究。因此，本研究旨在表征mGlu7/8异源二聚体相对于mGlu7/7和mGlu8/8同源二聚体的分子药理学，为理解这些受体在神经可塑性及相关疾病中的作用提供基础。

**主要技术方法（不超过250字）：**
研究人员利用嵌合mGlu7和mGlu8受体构建体（含GABAB1/GB1和GABAB2/GB2尾巴），通过羧基端修饰控制细胞表面二聚体亚基组成，特异性表达mGlu7/7同源二聚体、mGlu8/8同源二聚体及mGlu7/8异源二聚体。采用两种功能性检测：一是基于杂合G蛋白Gα15的钙离子升高检测（HEK293细胞）；二是基于天然Gi/o偶联G蛋白的G蛋白偶联内向整流钾通道（GIRK）介导的铊离子通量检测。此外，使用补充供体-受体共振能量转移（CODA-RET）检测，选择性测量mGlu7/8异源二聚体的G蛋白募集信号，避免同源二聚体的干扰。多克隆稳定细胞系经抗生素筛选后用于实验。

**研究结果：**
**1. 受控的mGlu二聚体亚基组成在细胞表面实现mGlu7/8异源二聚体分子药理学评估**
通过GB尾巴系统，在HEK293细胞中表达四种二聚体组合。对照实验表明，mGlu8 GB2质粒存在约20%的功能性“渗漏”，但整体系统允许特异性评估异源二聚体药理学。

**2. mGlu7/8异源二聚体对组III激动剂展现独特的药理学和选择性特征**
在钙升高检测中，mGlu7/8异源二聚体对谷氨酸和DL-AP4的效力显著低于mGlu8/8同源二聚体（pEC₅₀分别为5.05 vs 5.73和5.17 vs 6.41），且Hill斜率小于1（谷氨酸0.82，DL-AP4 0.70），提示异源二聚体存在两个不等价正构结合位点。值得注意的是，选择性mGlu8激动剂(S)-DCPG无法激活mGlu7/8异源二聚体，表明该受体可能需要两个激动剂结合位点同时占据才能达到饱和激活。

**3. (S)-DCPG作为mGlu7/8异源二聚体的选择性竞争性拮抗剂，竞争二聚体中mGlu8原聚体的DL-AP4结合**
通过Schild回归分析，增加(S)-DCPG浓度导致DL-AP4效力线性右移，且最大效应不变，表明竞争性拮抗。Schild斜率约0.5，提示竞争仅发生在mGlu8原聚体。在mGlu7/7同源二聚体上无拮抗作用，支持该特异性。

**4. 选择性组III mGlu受体PAMs在mGlu7/8异源二聚体上相对于同源二聚体增强激动剂浓度-反应左移能力**
在钙升高检测中，使用10 μM PAM预处理后比较谷氨酸效力左移倍数。仅VU0155094和VU6005649在mGlu7/8异源二聚体上显示显著更高的左移倍数（相对于mGlu7/7和mGlu8/8同源二聚体），而VU0422288、VU6046981等无此增强效应。

**5. 钙升高与GIRK检测中VU0155094效应的比较揭示差异影响**
在钙升高检测中，VU0155094对mGlu7/8异源二聚体左移DL-AP4效力达54.5倍，远高于同源二聚体。但在GIRK铊通量检测中，VU0155094对mGlu8/8和mGlu7/8的左移倍数无显著差异（3.9 vs 5.7），表明这种增强效应可能局限于杂合G蛋白系统。

**6. (S)-DCPG在GIRK检测中缺乏激动剂活性，并在CODA-RET检测中显示拮抗活性**
在GIRK检测中，(S)-DCPG对mGlu7/8异源二聚体仅显示极弱的部分激动作用（16.6%），而CODA-RET检测中，在EC₈₀浓度L-AP4存在下，(S)-DCPG呈剂量依赖性抑制异源二聚体活性（pIC₅₀ = 6.76），确证其拮抗剂特性。

**讨论与结论翻译：**
本研究证明mGlu7/8异源二聚体相对于mGlu7/7和mGlu8/8同源二聚体具有独特药理学特性，且三种受体对正构激动剂和别构调节剂具有不同的选择性特征。具体而言，mGlu7/8异源二聚体拥有两个不等价正构结合位点，可能需双位点占据才能饱和激活。选择性mGlu8激动剂(S)-DCPG在同源二聚体为完全激动剂，在异源二聚体为竞争性拮抗剂，其Schild斜率约0.5提示竞争仅发生在mGlu8原聚体。该化合物在成年海马中可能用于区分二聚体状态。在PAM研究中，VU0155094和VU6005649在杂合G蛋白检测中对异源二聚体显示增强效能，但在天然Gi/o耦联GIRK检测中无此差异，提示检测系统影响药理学表现。CODA-RET结果进一步支持(S)-DCPG的拮抗作用，且其亲和力在二聚体状态下相似。总体而言，本研究的结论是：mGlu7/8异源二聚体具有独特的药理学特性，为利用包含组III正构激动剂、拮抗剂和别构调节剂的药理学工具包选择性探测天然组织中mGlu7/7、mGlu8/8和mGlu7/8二聚体提供了强有力依据，同时为理解这些GPCR二聚体在海马神经可塑性和联想学习中的作用奠定了基础，并提示靶向该异源二聚体可能是治疗相关神经发育障碍的新策略。