scpp5通过矿化及Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路调控斑马鱼牙齿发育与损伤诱导的修复

《Molecules and Cells》：scpp5 Regulates Tooth Development and Injury-Induced Repair in Zebrafish through Mineralization and Wnt/β-Catenin Signaling

　　

摘要：分泌型钙结合磷蛋白(SCPP)家族成员scpp5在斑马鱼牙胚中特异性表达。初步数据显示scpp5缺失损害牙体矿化，但其分子机制及在牙修复中的作用尚不清楚。研究人员构建了scpp5-/-敲除及Tg(hsp70l:scpp5-GFP; cryaa:venus)过表达斑马鱼品系，利用Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)标记牙胚细胞，并通过硝基还原酶(NTR)/甲硝唑(MTZ)系统建立牙齿损伤模型。功能缺失研究表明，scpp5敲除抑制正常发育期间的牙体矿化及牙胚细胞发育，减弱Wnt/β-catenin信号，下调钙外流通道基因及釉基质(enameloid)和牙本质基质相关基因表达。挽救Wnt通路活性可恢复钙外流通道及牙本质基质基因表达，但不能恢复釉基质基因表达。功能获得研究表明，scpp5过表达对正常牙发育无影响，但在损伤后修复中加速矿化及细胞再生。机制上，修复期scpp5过表达激活Wnt/β-catenin信号，特异性上调钙通道及牙本质基质基因表达，不影响釉基质基因表达。综上，scpp5在正常发育中通过Wnt/β-catenin依赖性地调控釉基质和牙本质基质基因促进牙矿化；而在损伤修复中，scpp5通过选择性激活Wnt/β-catenin驱动牙本质基质及钙通道基因表达促进再生，且不依赖釉基质基因。

论文解读：scpp5通过Wnt/β-catenin信号通路调控斑马鱼牙齿发育与损伤诱导修复的研究

一、研究背景与意义

牙齿硬组织矿化始于细胞外有机基质中有序沉积的羟基磷灰石晶体，胞内钙离子(Ca²⁺)参与其生长与成熟。分泌型钙结合磷蛋白(Secretory Calcium-binding Phosphoprotein, SCPP)家族是钙代谢与矿化的关键调节因子，其中P/Q富含型SCPP成员scpp5在真骨鱼类牙组织中特异性表达，定位于内牙上皮细胞(Inner Dental Epithelial, IDE)和成牙本质细胞，但其对牙发育矿化及损伤修复的调控机制不明。已有研究表明scpp5敲除斑马鱼出现少牙表型，推测与牙替换延迟有关，具体机制未阐明。由于哺乳动物scpp5为假基因，其在斑马鱼中调控的下游矿化及Wnt/β-catenin通路可能具进化保守性，故本研究以斑马鱼为模型，探究scpp5在正常牙发育矿化及NTR/MTZ诱导牙损伤后修复中的功能与分子机制，为牙体矿化缺陷及相关组织工程靶点提供依据。本文发表于《Molecules and Cells》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用AB品系野生型(Wild Type, WT)斑马鱼，经伦理审批后开展实验。主要技术方法包括：(1)利用CRISPR/Cas9靶向scpp5第4外显子构建scpp5^-/-敲除品系；(2)构建启动子驱动质粒并显微注射获得Tg(scpp5:Dendra2-NTR)、Tg(hsp70l:scpp5-GFP; cryaa:venus)、Tg(hsp70l:wnt10a-GFP; cryaa:venus)等转基因品系；(3)利用Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)标记牙胚细胞，以12 mM MTZ处理(3–5 dpf)诱导NTR/MTZ系统介导的牙胚细胞消融建立牙齿损伤修复模型；(4)药物干预——高钙(30 mM CaCl₂)、高磷(30 mM复合磷酸钠)处理，Wnt激活剂SKL2001(20 μM)及抑制剂Zamaporvint(100 μM)处理；(5)表型检测：阿尔新红(Alizarin Red)染色、扫描电镜(SEM)与能谱(EDS)元素分析、显微CT(micro-CT)三维重建；(6)分子检测：整体原位杂交(WISH)、荧光原位杂交(FISH)、免疫荧光抗体染色(抗β-catenin、抗Dendra2等)、RT-qPCR检测矿化基质基因(ambn、enam、spp1、sprac)、钙外流通道基因(atp2b1b、slc24a3、slc24a4a、slc24a4b、atp2b4、slc8a1a、slc8a3)及Wnt通路基因(wnt10a、ctnnb1、axin2、c-myc、lef1)；热激(38.5 ℃, 40 min, 每12 h)诱导hsp70l启动子驱动的基因过表达。

三、研究结果

The role of SCPP5 in tooth mineralization during development（scpp5在正常牙发育中的矿化作用）

研究人员通过CRISPR/Cas9获得scpp5^-/-突变体(WISH及RT-qPCR证实scpp5 mRNA显著下降，突变致转录本不稳定且无非功能性蛋白)。Alizarin Red染色显示约20.59% scpp5^-/-斑马鱼9 dpf无牙矿化，其余个体牙本质矿化延迟；4V1釉基质至5 dpf仍呈Alizarin Red阳性(WT于4 dpf转阴并完成功能附着)。Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)示scpp5^-/-牙胚细胞发育显著迟于WT(2–7 dpf)。成年scpp5^-/-鱼牙尖形态异常，SEM见釉面粗糙伴凹陷，EDS显示牙面钙、磷含量显著降低。高钙(30 mM)而非高磷可部分挽救scpp5^-/-牙本质矿化但仍不能纠正釉基质异常Alizarin Red滞留。scpp5过表达在正常WT中不改变发育矿化及牙胚细胞发育；在scpp5^-/-背景下过表达可挽救牙本质矿化并使4V1釉基质Alizarin Red于5 dpf转阴。结论：scpp5缺失损害斑马鱼牙发育期釉基质与牙本质矿化及牙胚细胞发育，高钙可部分挽救牙本质矿化缺陷。

Role of scpp5 in tooth mineralization during tooth repair following injury（scpp5在损伤后牙修复矿化中的作用）

研究人员以Tg(dlx2b:Dendra2-NTR)斑马鱼用MTZ(3–5 dpf)处理建立牙损伤模型，R0D时3V1、5V1矿化消失，Dendra2及scpp5表达均被清除；修复期R3V、R5V矿化并附着但有形态异常。在损伤后修复期(R0D–R4D)对Tg(hsp70l:scpp5-GFP; cryaa:venus)行热激过表达scpp5，RT-qPCR证实scpp5上调，Alizarin Red显示修复期牙矿化加速，但4V1釉基质仍Alizarin Red阳性，R3V/R5V形态持续异常。结论：scpp5过表达不影响正常发育，但在损伤修复期可促进牙矿化修复与细胞再生，对釉基质矿化无影响。

Knockout of scpp5 impaired zebrafish tooth mineralization during development via Wnt/β-catenin signaling（scpp5敲除通过Wnt/β-catenin信号损害斑马鱼牙发育矿化）

RT-qPCR显示scpp5^-/-中钙外流通道基因(atp2b1b、slc24a3、slc24a4a、slc24a4b)显著下调；FISH示釉基质基因(ambn、enam)及牙本质基质基因(spp1、sprac)在4 dpf牙胚中表达降低。RT-qPCR筛选发现scpp5^-/-中wnt10a与ctnnb1(编码β-catenin)表达显著下降；免疫荧光显示核β-catenin蛋白水平降低；Wnt/β-catenin报告品系Tg(7xtcf:nls-mCherry)在scpp5^-/-牙胚中mCherry信号减弱；Wnt靶基因(axin2、c-myc、lef1)表达下调。用Wnt激活剂SKL2001或Tg(hsp70l:wnt10a-GFP; cryaa:venus)热激激活Wnt/β-catenin可恢复scpp5^-/-牙胚细胞发育、核β-catenin水平、mCherry信号及牙本质矿化，上调牙本质基质基因(spp1、sprac)和部分钙外流通道基因(slc24a3、slc24a4a、slc24a4b)，但未能恢复釉基质基因(ambn、enam)表达，4V1釉基质至5 dpf仍Alizarin Red阳性。结论：scpp5通过Wnt/β-catenin信号正向调控牙发育期钙外流通道及牙本质/釉基质基质基因表达；Wnt/β-catenin激活可挽救牙本质相关缺陷但无法补偿scpp5缺失对釉基质基因的直接调控。

scpp5 overexpression accelerated tooth mineralization during repair by activating the Wnt/β-catenin pathway（scpp5过表达通过激活Wnt/β-catenin通路加速修复期牙矿化）

损伤修复期scpp5过表达使R1D时钙外流通道基因(atp2b4、slc8a1a、slc8a3、slc24a3、slc24a4b)及牙本质基质基因(spp1、sprac)上调，牙胚细胞修复及矿化加速；ambn与enam无变化。热激过表达scpp5提升修复期牙胚细胞Wnt/β-catenin报告信号(mCherry)及核β-catenin水平；联合Zamaporvint(Wnt/β-catenin抑制剂)处理则抵消scpp5过表达对上述指标的上调作用，并抑制R1D、R2D牙矿化。结论：修复期scpp5过表达通过激活Wnt/β-catenin信号促进牙本质基质基因、钙外流通道基因表达及牙矿化修复，该促修复效应可被Wnt通路抑制所阻断。

四、讨论与结论翻译

讨论指出，scpp5在正常发育与损伤修复中具有情境依赖性双重功能：发育中scpp5为釉基质形成及Wnt依赖的基质基因表达所必需，缺失时Wnt/β-catenin受抑导致矿化障碍；修复中内源性scpp5因牙胚消融而不足，过表达scpp5通过激活Wnt/β-catenin选择性上调牙本质基质及钙通道基因促进再生，但不影响釉基质基因。釉基质异常(Alizarin Red持续阳性)不能被Wnt激活或补钙挽救，提示scpp5作为P/Q富含SCPP可直接参与釉基质羟磷灰石成核。SCPP5可能通过"由外向内(outside-in)"的细胞-基质反馈环路(如整合素-黏着斑感知胞外基质完整性)调控Wnt信号及矿化基因。尽管人类scpp5为假基因，SCPP-Wnt/β-catenin功能模块保守，为理解牙矿化缺陷及促牙修复策略提供参考。

结论(翻译)：

综上所述，scpp5缺失通过抑制Wnt/β-catenin信号通路损害斑马鱼牙齿发育过程中的牙体矿化；而scpp5过表达通过在损伤诱导修复中激活同一通路促进矿化。这些发现揭示了scpp5的情境依赖性双重作用，并突显SCPP5-Wnt/β-catenin轴可作为牙体组织工程的潜在治疗靶点。