结肠上皮中表达T细胞受体（TCR）的天然上皮内淋巴细胞定位依赖于GPR15与上皮来源的C10ORF99

《Mucosal Immunology》：Localization of TCR-expressing natural intraepithelial lymphocytes in the colon epithelium depends on GPR15 and epithelium-derived C10ORF99

　　

上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocytes，IELs）是机体内数量最多的淋巴细胞群体之一，在维持高度免疫刺激性黏膜部位上皮屏障完整性方面发挥关键作用。因此，阐明这些细胞如何生成、如何定位于上皮内部，以及如何参与屏障免疫，具有重要意义。尽管关于IEL生物学的大多数研究集中于小肠，但大肠上皮中同样存在IEL。此外，调控上皮下固有层（lamina propria）T细胞定位的归巢受体-配体对在小肠与大肠之间并不相同：小肠中为CCL25-CCR9，大肠中为C10ORF99-GPR15。CCL25-CCR9同样是小肠IEL正确定位所必需的，但控制大肠IEL定位的机制仍不清楚。研究人员在本文中证实，C10ORF99-GPR15通路对于大肠上皮中TCR⁺天然IEL的存在至关重要，而这一过程需要来源于上皮的C10ORF99（GPR15L）。

本文发表于《Mucosal Immunology》，聚焦于大肠上皮内淋巴细胞（IEL）在黏膜屏障稳态中的定位机制问题。肠腔环境具有高度免疫刺激性，而肠上皮仅由单层细胞构成，是隔绝腔内抗原与微生物进入组织内部的关键屏障。一旦该屏障受损，腔内抗原和微生物可跨越上皮，引发炎症反应，并可能进一步发展为炎症性肠病（IBD）。为维持这一屏障的稳态，肠上皮内部驻留着IEL这一特殊免疫细胞群。IEL能够持续监视上皮细胞状态，对感染或转化细胞作出反应，同时又具有较高活化阈值并可抑制过度炎症，因此在屏障保护与免疫耐受之间维持平衡。

既往研究已指出，IEL并非单一群体，而是由多类细胞组成。按是否表达T细胞受体（T cell receptor，TCR）可分为TCR⁺与TCR^- IEL；其中TCR⁺ IEL又可进一步分为天然上皮内淋巴细胞（natural IELs，nIELs）和外周诱导型上皮内淋巴细胞（peripherally induced IELs，pIELs）。nIELs直接由胸腺迁移至肠上皮，而pIELs则为激活后的常规αβ T细胞进入上皮。围绕小肠IEL的募集与定位，CCL25-CCR9轴已有较深入认识，但大肠中是否存在对应的特异性定位机制，以及这一机制是否同样适用于上皮内区室，则尚不明确。鉴于大肠固有层T细胞归巢依赖GPR15及其配体C10ORF99，而大肠与小肠在免疫生态、菌群负荷及归巢分子使用上均存在显著差异，因此有必要专门研究大肠上皮内IEL，尤其是nIEL的定位调控机制。

研究人员围绕C10ORF99-GPR15信号轴是否调控大肠上皮IEL定位这一核心问题，系统分析了野生型、Gpr15敲除、C10orf99敲除、Gpr15/C10orf99双敲除以及上皮特异性C10orf99条件敲除小鼠中的IEL与固有层T细胞。研究结果表明，GPR15及其配体C10ORF99对于大肠上皮中TCR⁺ nIEL的存在均是必需的，而对TCR⁺ pIEL及TCR^- IEL总体上并非必需。更进一步，来源于上皮的C10ORF99是这一过程中的关键来源，提示大肠上皮本身不仅是屏障结构，也主动参与免疫细胞空间定位的分子调控。该研究的重要意义在于，将原本主要被理解为“大肠固有层归巢轴”的C10ORF99-GPR15，扩展为调控“大肠上皮内天然IEL定位”的关键通路，从而深化了对大肠黏膜免疫分区调控的认识，也为炎症性肠病靶向GPR15的治疗策略提供了新的风险—获益考量。

在技术方法方面，研究主要采用多种基因修饰小鼠模型，包括Gpr15敲除、C10orf99全身敲除、Gpr15/C10orf99双敲除以及利用CRISPR与同源重组构建的C10orf99条件敲除小鼠，并与VillinCre杂交实现肠上皮特异性删除。样本来源为6–12周龄、C57BL/6背景小鼠。研究人员分离大肠上皮内与固有层免疫细胞，采用流式细胞术（flow cytometry）定量分析IEL及GPR15⁺ T细胞亚群，并通过PCR验证loxN位点插入和条件性缺失在不同细胞组分中的特异性。

在研究结果部分，论文首先以“GPR15 is required for the localization of TCR-expressing natural IELs to the epithelium of the large intestine”为题，说明研究人员通过流式细胞术发现，大肠上皮IEL各亚群表面GPR15表达水平并不一致。进一步在Gpr15缺失背景下比较不同IEL亚群后发现，TCR⁺ nIEL群体显著减少，具体包括总体TCRαβ⁺ T细胞、CD8αα⁺TCRαβ⁺ T细胞及TCRγδ⁺ T细胞，而以pIEL为主的CD4⁺TCRαβ⁺与CD8αβ⁺TCRαβ⁺群体未见明显改变，TCR^- IEL亦不受影响。对盲肠与结肠分别分析后，所得趋势一致，说明GPR15对大肠不同解剖部位中的TCR⁺ nIEL定位均具有重要作用。该部分结果确立了GPR15是大肠上皮中天然TCR⁺ IEL定位所必需的关键受体。

其次，在“C10ORF99 is required for the localization of TCR-expressing natural IELs to the large intestine epithelium”部分，研究人员从配体角度进行了互补验证。比较野生型与C10orf99敲除小鼠后发现，缺失C10ORF99同样导致大肠上皮中TCR⁺ nIEL显著下降，而CD4⁺TCR⁺ pIEL及TCR^- IEL未受显著影响。这提示TCR⁺ nIEL在大肠上皮中的募集或滞留依赖C10ORF99-GPR15信号轴。研究还指出，C10orf99敲除中CD8αβ⁺TCRαβ⁺ pIEL下降这一现象与Gpr15敲除不完全一致，但作者结合不同队列中pIEL基线波动较大、SPF环境下环境抗原暴露不足等观察，认为这一差异更可能与pIEL发育变异性有关。进一步通过比较Gpr15单敲与Gpr15/C10orf99双敲小鼠，研究人员未观察到C10ORF99对TCR⁺ nIEL存在显著的GPR15非依赖性作用，从而说明IEL表型主要通过GPR15介导。

第三，在“Generation of C10orf99 conditional KO mice”部分，研究人员为解析不同来源C10ORF99的功能，构建了C10orf99条件敲除小鼠。他们在外显子3两侧非编码区引入loxN位点，并通过PCR验证插入成功。随后比较野生型与C10orf99^fl/fl小鼠固有层CD4⁺ T细胞和GPR15表达CD4⁺ T细胞后发现，两组间GPR15介导的T细胞向大肠固有层迁移并无显著差异。这说明loxN位点插入本身未干扰C10ORF99的正常表达与功能，为后续上皮特异性删除实验奠定了模型基础。

第四，在“Epithelium-derived C10ORF99 is required for the localization of TCR-expressing natural IELs”部分，研究人员将C10orf99条件敲除小鼠与VillinCre小鼠杂交，以实现肠上皮中特异性缺失C10orf99。PCR结果证实，该缺失限于肠上皮细胞。进一步分析发现，与C10orf99^fl/fl对照相比，VillinCreC10orf99^fl/fl小鼠大肠上皮中TCRγδ⁺ nIEL、TCRαβ⁺ nIEL及CD8αβ⁺TCRαβ⁺ pIEL明显减少，而CD4⁺TCRαβ⁺ pIEL和TCR^- IEL无显著变化。与此同时，在大肠固有层中，缺失上皮来源C10ORF99仅引起GPR15⁺ T细胞轻度但具有统计学意义的下降，其程度小于全身性C10orf99敲除。该结果表明，上皮来源C10ORF99对于TCR⁺ nIEL定位到大肠上皮是必需的，而对于固有层GPR15⁺ T细胞募集仅具有部分贡献。这提示C10ORF99除参与经血管内皮的外渗过程外，还可能在T细胞进入组织后进一步引导其向上皮迁移，或帮助其在固有层/上皮内滞留。

在讨论部分，作者指出，本研究将C10ORF99-GPR15轴的功能范围从“大肠固有层T细胞归巢”扩展到了“大肠上皮TCR⁺ nIEL定位”，并明确了上皮来源C10ORF99是其中必要的配体来源。这一发现表明，大肠的淋巴细胞定位不仅区别于小肠，而且在同一器官内部的固有层与上皮区室之间也具有分层调控特征。作者进一步讨论认为，nIEL前体在穿越血管内皮进入组织后，可能仍需要C10ORF99-GPR15信号引导其继续向上皮迁移，或维持其在上皮中的停留；而上皮来源C10ORF99缺失导致固有层GPR15⁺ T细胞轻度下降，也支持该通路在外渗之后仍发挥作用。对于该通路究竟主要介导募集、滞留还是二者兼具，作者认为尚待进一步研究。

作者还强调，本研究对炎症性肠病治疗具有直接启示意义。由于成人人类结肠中GPR15⁺效应T细胞可积聚，因此阻断GPR15被认为可能减少致病性T细胞向结肠固有层募集，具有治疗潜力。然而，本研究显示该通路同时也是结肠上皮中保护性TCR⁺ nIEL定位所必需，特别是可能影响TCRγδ⁺ nIEL与CD8αα⁺TCRαβ⁺ nIEL等具有保护作用的群体。因此，GPR15阻断在抑制致病性T细胞的同时，也可能削弱结肠上皮天然保护性免疫，从而抵消部分治疗获益。作者同时指出，C10ORF99还具有GPR15非依赖性的上皮生物学功能，但本研究通过双敲比较确认，IEL相关表型主要依赖GPR15介导，这一点可与其其他上皮效应相区分。

综合全文，研究结论可译为：C10ORF99-GPR15信号通路不仅参与大肠固有层T细胞归巢，而且是大肠上皮中TCR⁺天然上皮内淋巴细胞正确定位所必需的关键机制；其中，上皮来源的C10ORF99是这一过程不可缺少的配体来源。该发现揭示了大肠黏膜免疫细胞空间分布的特异性调控机制，并提示针对GPR15的治疗性干预在炎症性肠病中可能同时影响致病性T细胞与保护性天然IEL，因而需要审慎评估其免疫学后果。