Mycobacterium tuberculosis（Mtb）感染前限时喂养减少组织CD4+ T细胞且对细菌清除影响有限

《FEBS Open Bio》：Time-restricted feeding prior to Mycobacterium tuberculosis infection reduces tissue CD4+ T cells with limited impact on bacterial clearance

　　

限时喂养（Time-restricted feeding, TRF）对细菌感染期间免疫应答的影响尚待深入研究。研究人员将6–8周龄雄性小鼠进行每日8小时限时喂养（TRF）并持续30天，随后以低剂量结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）H37Rv感染。在TRF前15天内，TRF改善了葡萄糖耐量并伴有轻微体重下降。然而，全局血清与肝脏代谢组学分析以及肝脏蛋白质组学分析显示，TRF扰乱了脂肪酸生物合成与降解、类固醇激素生物合成以及酪氨酸代谢。这些结果表明，TRF可能影响了宿主免疫细胞的分布与功能。TRF小鼠在感染后21天的肺与脾中具有相似的结核分枝杆菌载量，但其骨髓中CD3+ T细胞以及骨髓和肺中CD4+ T细胞均显著降低。最终，研究人员证实TRF诱导的氨基酸与脂质代谢改变在Mtb感染期间持续存在。

## 一、研究背景与问题提出

限时进食/限时喂养（Time-rerestricted eating/feeding, TRE/F）是一种将每日进食时间窗口限制在6–12小时的饮食干预方式，通过延长每日空腹时间，能够减轻超重、肥胖及糖尿病前期个体的体重并改善代谢状态。然而，关于TRF对免疫系统的影响及其在感染性疾病如结核病（Tuberculosis, TB）中的作用尚不明确。既往研究表明，夜间限制性TRF可减少小鼠脂肪量、缓解高脂饮食诱导的体重增加并改善葡萄糖稳态，同时降低炎症因子表达，但其在感染背景下的作用研究有限。

鉴于TRF在细胞或组织水平增强宿主代谢的潜在作用，研究人员旨在探究30天TRF对雄性C57BL/6小鼠免疫系统的影响及其对Mtb H37Rv感染的作用，以期为开发有益于结核病患者的靶向饮食干预提供依据。该研究由Yadav等完成，发表于《FEBS Open Bio》。

## 二、主要技术方法

研究人员采用6–8周龄雄性C57BL/6小鼠，建立8小时TRF（ZT13–ZT21）与自由进食对照模型，持续30天后经气溶胶途径以低剂量（100–400菌落形成单位，Colony-forming unit, CFU）动物传代Mtb H37Rv感染。主要技术方法包括：（1）腹腔葡萄糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test, iPGTT）及酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测血清胰岛素、游离脂肪酸与稳态模型评估胰岛素抵抗指数（Homeostatic model assessment of insulin resistance, HOMA-IR）；（2）液相色谱–质谱联用（Liquid chromatography–mass spectrometry, LC–MS）进行血清非靶向代谢组学分析，气相色谱–质谱联用（Gas chromatography–mass spectrometry, GC–MS）进行肝脏代谢组学分析；（3）串联质谱（LC–MS/MS）结合超高效液相色谱（Ultra-high-performance liquid chromatography, UHPLC）进行肝脏蛋白质组学分析，数据库搜库采用UniProt鼠源蛋白组数据库，以5%错误发现率（False discovery rate, FDR）筛选差异蛋白；（4）感染后第1天和第21天进行组织结核分枝杆菌菌落计数；（5）流式细胞术分析骨髓、肺和脾中CD3+和CD4+ T细胞比例；（6）LEGENDplex多因子检测分析血清细胞因子。统计分析采用双尾非配对t检验、Mann–Whitney U检验或Welch's t检验，代谢组学与蛋白质组学数据经MetaboAnalyst平台进行主成分分析（Principal component analysis, PCA）和通路富集分析。

## 三、研究结果

### TRF影响体重增长并作用于宿主葡萄糖稳态

TRF组与自由进食组食物摄入量相近，前两周TRF组体重下降1.5%，30天后TRF组体重增长5.49%，显著低于自由进食组的16.62%。第14天时TRF组腹腔葡萄糖耐量试验曲线下方面积显著降低，提示葡萄糖耐量改善；但第21天和第28天两组间无显著差异。第15天和第28天的空腹血清胰岛素、游离脂肪酸水平及HOMA-IR在两组间均相似。

### TRF改变氨基酸与脂肪酸代谢

血清代谢组学PCA显示TRF组与自由进食组部分重叠，共鉴定1123种代谢物，其中51种差异表达，涉及丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、精氨酸/脯氨酸代谢、酪氨酸代谢、脂质生物合成（脂肪酸延长与降解）、嘧啶代谢及类固醇激素生物合成通路。TRF组血清棕榈油酸水平显著降低，胞苷和胱氨酸水平升高。肝脏代谢组学通过GC–MS鉴定119种代谢物，其中8种（丙酸、甲基马来酸、葡萄糖酸、赖氨酸、苯甲醛、10-十一炔酸、阿拉伯糖酸、核糖内酯）差异表达，涉及生物素代谢、丙酸代谢、磷酸戊糖通路和赖氨酸降解通路。肝脏蛋白质组学PCA显示两组完全分离，TRF组437种蛋白下调、152种蛋白上调，通路富集分析显示脂肪酸β-氧化上调而脂质生物合成下调，同时有氧呼吸和电子传递链相关蛋白（如ATP合酶F1复合体α亚基、细胞色素c氧化酶亚基5A、甘油醛-3-磷酸脱氢酶）丰度增加。

### 感染前30天TRF暴露对21天组织结核分枝杆菌载量影响轻微

完成30天TRF后，小鼠经气溶胶感染Mtb H37Rv，感染后TRF组恢复自由进食。21天时，TRF组与自由进食组体重、随机血糖水平相似，肺、脾和肝脏的肉眼病理改变相近，肺和脾的结核分枝杆菌载量亦无显著差异。因此，TRF预暴露未能增强C57BL/6小鼠早期（21天）的组织细菌清除能力。

### Mtb感染前暴露于TRF的小鼠表现出差异化的组织免疫细胞分布

流式细胞术分析显示，感染后21天，TRF组骨髓中CD3+ T细胞和CD4+ T细胞比例显著低于自由进食组；肺中CD4+ T细胞比例也显著降低；脾中CD3+和CD4+ T细胞绝对数相似，但CD4+ T细胞频率显著降低。两组间血清IL-6、IFN-γ和IL-1α水平无显著差异。这表明TRF预暴露减少了宿主抗Mtb防御所需的关键免疫细胞数量，但未对早期组织细菌清除产生不利影响。

### TRF诱导的代谢改变在TRF-TB小鼠中持续存在

感染后21天，TRF-TB组与ALF-TB组血清代谢组PCA显示明显分离，1120种代谢物中22种差异表达，通路富集显示烟酸/烟酰胺代谢、鞘脂代谢、脂肪酸和类固醇激素生物合成通路紊乱。肝脏代谢组PCA略有重叠，121种代谢物中14种差异表达，涉及亚油酸代谢、果糖/甘露糖代谢、半乳糖代谢、不饱和脂肪酸生物合成、酪氨酸代谢、氨基酸和核苷酸糖代谢及花生四烯酸代谢。肝脏蛋白质组PCA显示两组差异显著，56种蛋白差异表达，通路富集显示有氧呼吸、呼吸电子传递链、单羧酸代谢过程上调，以及对细菌来源分子的应答和FcγR介导的吞噬作用等免疫系统相关通路改变。相关性分析显示电子传递链蛋白（Atp5f、Cox5a、Sdhaf4）间呈显著正相关。这些结果证实TRF诱导的氨基酸和脂肪酸代谢改变在其终止后仍持续存在。

## 四、讨论与结论

研究人员讨论了TRF对体重和代谢的影响：TRF初期体重下降但后期恢复，与既往人类TRE研究一致；正常饲料条件下TRF对葡萄糖稳态的改善作用短暂，可能与6–8周龄C57BL/6小鼠尚未出现胰岛素抵抗有关，不同于高脂饮食模型。TRF通过持续循环的进食-空腹周期深刻影响营养利用，进而重塑宿主代谢表型。循环和肝脏中氨基酸代谢（丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸、精氨酸/脯氨酸、酪氨酸代谢）和脂肪酸代谢相关通路富集，肝脏蛋白质组显示脂肪酸氧化增强、氧化磷酸化依赖增加，这些改变与既往报道相符。

关于TRF对感染免疫的影响，研究指出21天时CD4+ T细胞减少但未损害细菌控制，提示TRF可能增强CD4+ T细胞功能。该研究是首批探究TRF对Mtb感染影响的课题之一，与既往热量限制（Caloric restriction, CR）研究结果存在差异，可能源于能量代谢差异、小鼠品系（C57BL/6 vs. DBA/2）、时间点（21天vs. 40天）及感染途径（气溶胶vs. 静脉）的不同。

研究局限性包括：未评估CD3+或CD4+ T细胞功能、未涉及巨噬细胞和中性粒细胞等其他免疫细胞、缺少感染期间持续TRF或感染后启动TRF的实验组，以及年龄因素可能影响结果。

综上，研究人员得出结论：30天限时喂养重塑宿主氨基酸与脂质代谢表型，这些有益效应在TRF终止后仍持续存在。然而，终止TRF对21天时的结核分枝杆菌清除无额外优势。TRF预暴露虽影响组织代谢和免疫细胞分布（CD3+和CD4+ T细胞减少），但并未损害宿主清除结核分枝杆菌的能力，提示TRF预暴露可能改善CD3+和CD4+ T细胞功能。