自噬溶酶体在荧光蛋白核转位中的参与作用评估

《FEBS Open Bio》：Evaluating the involvement of autolysosomes in the nuclear translocation of fluorescent proteins

　　

在构建mCherry标记的HeLa细胞对照株过程中，研究人员意外观察到细胞核内出现红色荧光，因此进一步探究荧光蛋白（FPs）进入细胞核的机制。研究证实，mCherry及mCherry/EGFP串联荧光蛋白均可发生核转位，并发现FPs可被自噬体摄取，在进入溶酶体后转运至细胞核。然而，药理学抑制自噬体-溶酶体融合以及敲低syntaxin 17后，HeLa细胞中mCherry的核转位减少，而HepG2细胞中未见相同现象，提示自噬过程也可能参与FPs的核转位。电子显微镜结果显示，在HeLa细胞中，自噬溶酶体可与核膜融合并延续进入细胞核，而在HepG2细胞中未观察到该现象，表明在HeLa细胞中，自噬参与了FPs的核转位。此外，免疫透射电子显微镜（ITEM）显示，FPs还可通过核孔复合体（NPC）直接进入细胞核。上述结果提示，自噬参与了FPs的细胞内降解及核内转位过程。

该研究发表于《FEBS Open Bio》，聚焦于一个细胞生物学中较少被直接解析的问题，即外源表达的荧光蛋白（FPs）为何会出现在细胞核内，以及这一现象是否反映了更普遍的蛋白质核转运机制。研究背景在于，既往已有多种受体配体被发现可与受体或独立地定位于细胞核内，但其进入细胞核的具体路径并不清楚。研究人员在建立mCherry标记HeLa细胞时，意外发现核内红色荧光信号，由此提出：缺乏已知核定位信号（NLS）的荧光蛋白，可能并非仅依赖经典核孔复合体（NPC）转运，也可能与自噬-溶酶体系统有关。由于蛋白聚集体可经自噬降解，而荧光蛋白也可能受到相关机制处理，因此有必要明确自噬体、溶酶体及核膜之间是否存在与核转位相关的联系。

研究人员围绕HeLa与HepG2两种细胞展开比较研究。结果表明，mCherry及mCherry/EGFP串联蛋白不仅能够出现在细胞核内，而且在HeLa细胞中，这一过程与自噬体-溶酶体融合、自噬溶酶体进入细胞核以及核膜结构改变密切相关；而在HepG2细胞中，虽然也可见一定核内信号，但其机制更可能偏向通过NPC的直接转运。研究的重要意义在于，论文提出了荧光蛋白核转位存在至少两条细胞内路径：一条是分子量允许情况下经NPC进入细胞核；另一条是在特定细胞背景下，经自噬溶酶体与核膜融合后释放入核。这一发现不仅修正了对荧光蛋白细胞内定位的常规认识，也提示某些内源性蛋白或受体配体的核内转位，可能与溶酶体行为异常或特定病理状态有关。

研究所用主要技术方法包括：构建稳定表达mCherry及mCherry/EGFP串联蛋白的HeLa和HepG2细胞株；采用激光共聚焦显微镜进行活细胞时序成像与固定细胞成像，联合LysoTracker Deep Red、DAPGreen及LC3B-GFP追踪溶酶体、自噬体与荧光蛋白的共定位；通过Western blot验证表达蛋白分子量；使用EACC抑制自噬体-溶酶体融合，并以STX17 siRNA进行RNA干扰定量分析核内mCherry变化；进一步采用透射电子显微镜（TEM）观察超微结构，并以免疫透射电子显微镜（ITEM）检测串联蛋白在NPC处的定位。样本来源为培养的HeLa细胞与HepG2细胞。

在结果部分，论文首先以“Confirmation of molecular size of FPs expressing in HepG2 and HeLa cells”为题说明：Western blot结果显示，两类细胞中表达的荧光蛋白分子量与理论值一致，提示实验所用蛋白未因额外氨基酸序列插入而获得已知NLS，这为后续讨论其非经典核转位机制提供了前提。

在“Tracking of expressing fluorescent protein, autophagosome and lysosome”部分，研究人员通过共聚焦追踪发现，mCherry及mCherry/EGFP串联蛋白在HeLa细胞核内明显积聚。进一步的共定位分析显示，mCherry可与溶酶体标记物以及部分自噬体标记物共定位；LC3B与mCherry斑点的重叠则支持荧光蛋白可进入自噬相关降解通路。更关键的是，活细胞时序成像观察到，带有LysoTracker信号的颗粒可直接进入HeLa细胞核，提示进入细胞核的并非游离荧光，而是与溶酶体相关的颗粒结构。串联蛋白中的EGFP在酸性环境下荧光暂时淬灭，进入细胞核后又恢复，说明这些颗粒曾处于酸化溶酶体环境。固定样本与活细胞结果结合后，研究认为HeLa细胞中荧光蛋白在溶酶体内并未被完全降解，而HepG2细胞中则更接近完全降解状态。

在“The effects of pharmacological inhibition and knockdown of STX17 on nuclear translocalization of mCherry”部分，研究人员通过功能干预检验自噬是否参与核转位。比较显示，HeLa细胞核内mCherry积聚程度高于HepG2细胞。EACC抑制自噬体-溶酶体融合后，HeLa细胞核内mCherry显著、剂量依赖性下降，而HepG2细胞变化不显著。进一步敲低STX17后，HeLa细胞核转位同样明显减少，HepG2细胞则无显著变化。该部分结果直接支持：HeLa细胞中荧光蛋白核转位依赖自噬体与溶酶体融合过程，而这一依赖性并不普遍存在于所有细胞类型。

在“Autolysosome and nucleus in HepG2 and HeLa cells: The study using TEM”部分，TEM提供了关键形态学证据。研究人员在HepG2细胞中未见溶酶体或自噬溶酶体与细胞核融合；而在HeLa细胞中，观察到自噬溶酶体的双层膜与核膜连续，且存在向核内开放的结构。这提示HeLa细胞中确实存在自噬溶酶体与核膜融合并向核内释放内容物的超微结构基础，是全文最重要的机制性证据之一。

在“Intracellular localization of tandem FP in HepG2 cells”部分，研究人员利用ITEM证明另一条转运路线的存在。未转染HepG2细胞中无GFP免疫反应，而转染后可在胞质、细胞核以及NPC处检测到EGFP信号，说明分子量约55 kDa的串联荧光蛋白可经过NPC进入细胞核。因此，即使在缺乏HeLa样自噬溶酶体-核膜融合现象的细胞中，荧光蛋白仍可能通过经典核孔运输实现核定位。

讨论部分综合指出，研究结果支持两种并行但细胞类型依赖的核转位机制。其一，荧光蛋白分子量低于约60 kDa，即使缺乏NLS，也可能经NPC进入细胞核；其二，在HeLa细胞中，荧光蛋白先进入自噬体，再与溶酶体融合形成自噬溶酶体，随后该结构与核膜融合并向核内开放，使未被完全降解的荧光蛋白进入细胞核。研究同时强调，HeLa细胞中自噬溶酶体内容物及内膜降解可能不充分，这或许是该机制得以发生的重要条件；相较之下，HepG2细胞中荧光蛋白在溶酶体内更易被降解，因此不易形成相同的核内转运现象。论文进一步指出，这一现象可能不仅限于外源荧光蛋白，也可能对理解某些受体配体或内源蛋白的核内转位具有启发意义，但其生理或病理后果仍需进一步研究验证。

研究结论可译为：研究结果表明，在HeLa细胞中，与核膜融合并进入细胞核的自噬溶酶体参与了荧光蛋白的核转位。由于溶酶体也参与晚期内体的降解过程，这提示溶酶体行为也可能导致受体配体发生核转位。因此，溶酶体进入细胞核的现象，可能也出现在其他蛋白质或肽类的降解过程中。当前发现提示，细胞核在某些细胞类型中可能参与多种内源性蛋白的降解相关过程，但仍需进一步研究加以证实。