《FEBS Open Bio》：Loss of AMBRA1 activates MAPK and angiogenesis signaling pathways in melanoma cells
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摘要：自2007年发现的Beclin1调控自噬激活分子1（activating molecule in Beclin1-regulated autophagy1，AMBRA1）对自噬至关重要，并在神经系统发育、细胞存活与增殖中发挥重要作用。研究人员采用基于系统
摘要：自2007年发现的Beclin1调控自噬激活分子1（activating molecule in Beclin1-regulated autophagy1，AMBRA1）对自噬至关重要，并在神经系统发育、细胞存活与增殖中发挥重要作用。研究人员采用基于系统的“组学”（omics）方法并以黑色素瘤为焦点，研究了AMBRA1在多种细胞过程中的参与情况。对AMBRA1过表达或敲低（knock-down）的转录组分析显示，若干转录本发生显著失调。研究人员确定了AMBRA1在一系列细胞通路中的若干新作用，包括癌症信号通路如MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）、血管生成、组织生长因子信号、轴突导向以及Wnt信号。此外，研究人员利用酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2H）实验鉴定了新的结合伴侣，为AMBRA1在不同细胞过程中的新作用提供了证据。最终研究人员得出结论：AMBRA1缺失上调转移相关基因/蛋白，凸显AMBRA1作为黑色素瘤中的抑癌基因。
研究背景方面，黑色素瘤（melanoma）占皮肤癌死亡人数的75%，是全球最具侵袭性与治疗抵抗的恶性肿瘤之一，若未能早期诊治极易发生转移，尽管免疫疗法、靶向治疗及联合策略取得一定进展，转移性病例的治疗响应仍仅约50%，因而亟需基于肿瘤分子特征开发个体化疗法。[citation:1-5] AMBRA1（activating molecule in Beclin1-regulated autophagy1，Beclin1调控自噬激活分子1）系支架蛋白，核心功能为调控自噬、神经系统发育、代谢、凋亡与细胞增殖，在多种癌症中呈双重角色：在部分肿瘤具抑癌作用，在另一些则表现促瘤作用；已有证据表明AMBRA1缺失与黑色素瘤转移相关，其可通过关联PP2CA（蛋白磷酸酶2CA）使c-MYC去磷酸降解、并促进Cyclin D降解以抑制CDK4/6过度激活从而阻遏增殖，但AMBRA1缺失促进黑色素瘤发生的具体机制尚未完全阐明。[citation:6-13] 为此，研究人员在本文中综合利用公共数据库的人类黑色素瘤DNA、微阵列与RNA-Seq数据集评估AMBRA1突变及在原发与转移灶中的表达，通过对A375黑色素瘤细胞系进行AMBRA1过表达与敲低（knock-down）的转录分析，并鉴定AMBRA1蛋白互作伴侣，以揭示AMBRA1缺失在黑色素瘤中激活的相关通路与新功能，论文发表于《FEBS Open Bio》。
主要关键技术方法如下：研究人员对公共数据集开展生物信息学分析，包括用GEO2R分析GEO中GSE15605（46例原发、16例癌旁正常、12例转移黑色素瘤）与GSE59455（39例原发、102例转移） microarray数据，用cbioportal分析TCGA皮肤 cutaneous黑色素瘤（SKCM，PanCancer Atlas UID:10428与Firehose Legacy UID:10490）的RNA-Seq标准化计数与突变谱，用Gepia2做生存分析，用Depmap门户分析依赖度；细胞实验采用A375、MeWo、SKMEL28黑色素瘤细胞系，构建AMBRA1过表达（慢病毒/逆转录病毒载体）与敲低（shRNA靶向AMBRA1的慢病毒感染）的稳定株，以β-Gal（β-半乳糖苷酶）与scramble shRNA为对照；通过Incucyte活细胞成像生长曲线、Western blot（以无染料 stain-free凝胶总蛋白归一化）检测AMBRA1及FLT1(VEGFR1)、Wnt5a等蛋白；提取总RNA行GeneChip Human Gene 2.0 ST microarray（3次生物学重复，TAC软件Ebayes ANOVA分析，P<0.05且FDR<0.09，GO与STRING做功能与互作网络分析）；用酵母双杂交（Y2H）系统构建AMBRA1与PPP2CA（蛋白磷酸酶2CA）等cDNA于酵母表达载体，行蛋白互作筛选与阳性/阴性对照验证。
结果部分：AMBRA1 expression in melanoma（黑色素瘤中AMBRA1的表达）：研究人员通过分析多个公开数据集发现，在GSE15605中AMBRA1在癌旁正常皮肤表达显著低于原发（P<0.001）与转移黑色素瘤（P<0.001），但在GSE59455、TCGA SKCM PanCancer Atlas、TCGA Firehose中原发与转移间无显著差异；TCGA队列中AMBRA1表达高低未关联总生存或无病生存；cbioportal显示SKCM中AMBRA1突变率约10%，为子宫内膜癌后第二高，以错义（35事件）、截短（9事件）为主，散在分布于基因各区域而非特定结构域，突变型患者AMBRA1 mRNA水平显著低于野生型（P=0.0093），表明部分黑色素瘤倾向于AMBRA1丢失。
Effect of AMBRA1 knockdown on melanoma cell growth（AMBRA1敲低对黑色素瘤细胞生长的影响）：研究人员构建A375过表达AMBRA1（rAMBRA1）与对照rBGal（β-Gal）、敲低shAMBRA1与shScramble稳定株，Western blot确认表达改变并以stain-free总蛋白归一化；活细胞成像显示过表达AMBRA1不影响A375生长曲线，而shAMBRA1显著减慢细胞增殖；撤除筛选抗生素2周后shAMBRA1细胞生长恢复，伴随AMBRA1蛋白水平部分回升，说明A375在培养中对AMBRA1表达具有一定依赖性。
其余结果部分在上传文档中未给出详细小节正文（仅见Fig.2标注后续有F等面板但未提供对应文字），故依据原文只总结至此：研究人员通过转录组microarray分析shAMBRA1 vs shScramble及rAMBRA1 vs rBGal，发现AMBRA1缺失显著失调多条通路转录，包括MAPK、血管生成、TGF（组织生长因子）信号、轴突导向、Wnt信号等（此结论在摘要与引言末句明确提及）；Y2H实验鉴定出AMBRA1新的互作蛋白如PPP2CA等，为其在泛素介导调控、转录与翻译中的新角色提供证据（摘要与Materials中Y2H部分及cDNA构建PPP2CA/AMBRA1段有明确出处）。
讨论与结论部分：研究人员综合生物信息学队列分析、细胞模型转录组与蛋白互作实验结果，指出AMBRA1在部分黑色素瘤中以突变或表达降低形式丢失，AMBRA1缺失虽在A375培养模型中减缓增殖（细胞对其有表达依赖），但同时引起转移相关基因/蛋白上调，并特异性激活MAPK信号与血管生成等促侵袭转移通路；Y2H鉴定的新结合伴侣进一步支持AMBRA1在自噬之外参与蛋白稳定性调控、转录与翻译等多样细胞过程；由此研究人员认为AMBRA1在黑色素瘤中发挥抑癌基因功能，其缺失不仅通过既往已知Cyclin D/c-MYC降解缺失促增殖，更通过激活MAPK与血管生成等通路增强转移表型，这为理解AMBRA1复杂生物学功能及潜在治疗靶点提供了新依据。
