静水压力通过β-连环蛋白(β-catenin)激活缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)促进乳腺癌细胞干性(Stemness)

《FEBS Open Bio》：Hydrostatic pressure activates HIF-1α via β-catenin to promote stemness in breast cancer cells

　　

摘要：肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)在调控癌细胞生物学特性中发挥关键作用。恶性实体瘤中组织间液静水压力(Hydrostatic pressure, HP)通常升高。尽管研究人员此前已证实升高的HP可稳定癌细胞中缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的表达，但本研究进一步探究升高的HP是否可促进癌细胞获得干性(Stemness)特征。研究结果显示，暴露于50 mmHg HP 48 h对人乳腺癌细胞存活率或形态无显著影响。然而，50 mmHg HP刺激显著提高了MCF-7和BT-474乳腺癌细胞中乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)活性，并上调HIF-1α及干性标志物(CD44和SSEA-1，即阶段特异性胚胎抗原-1)，但在MDA-MB-453乳腺癌细胞系中未见此变化。相应地在MCF-7和BT-474细胞系中，50 mmHg HP刺激下β-连环蛋白(β-catenin)显著增强，而在MDA-MB-453乳腺癌细胞中呈阴性表达。缺氧(1% O2)处理48 h也仅在MCF-7和BT-474细胞系中显著增强β-catenin表达，但在包括β-catenin缺陷型MDA-MB-453细胞在内的所有测试乳腺癌细胞系中均增加HIF-1α表达及ALDH活性。因此研究人员得出结论：恶性肿瘤中升高的HP可能通过β-catenin增强HIF-1α表达，从而促进癌细胞获得"干性"特征。

论文解读：静水压力通过β-catenin激活HIF-1α促进乳腺癌细胞干性的研究

本研究发表于《FEBS Open Bio》。目前已知肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)中生物力学因素如细胞外基质(extracellular matrix, ECM)刚度和组织间液静水压力(Hydrostatic pressure, HP)升高可影响肿瘤进展，乳腺癌组织中HP可达4.0–53.0 mmHg（正常组织仅0.0–3.0 mmHg）。已有研究表明HP可促进癌细胞转移，且HP能稳定缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)，而HIF-1α与癌症干细胞(Cancer stem cells, CSCs；具自我更新及致瘤潜能的肿瘤细胞亚群)的维持密切相关，高乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)活性和CD44、SSEA-1(Stage-specific embryonic antigen-1)是CSC常用标志物。然而HP是否通过特定分子机制诱导乳腺癌细胞获得干性尚未明确。Wnt信号关键分子β-连环蛋白(β-catenin)已被报道参与机械力感受(Mechanotransduction)。因此研究人员假设恶性肿瘤中升高的HP可通过β-catenin-HIF-1α轴促进乳腺癌细胞获得干性特征，并以三种人乳腺癌细胞系(MCF-7、BT-474及β-catenin缺陷型MDA-MB-453)为对象开展验证。

主要关键技术方法

研究人员采用三种人乳腺癌细胞系——MCF-7(RRID:CVCL_0031)、MDA-MB-453(RRID:CVCL_0418，已知β-catenin缺陷)及BT-474(RRCL:RRID:CVCL_0179)，使用气动加压系统施加50 mmHg HP持续48 h，以常氧无HP为对照(CON组)，并设置1% O₂缺氧处理48 h(Hypo组)作比较。通过台盼蓝拒染法检测细胞存活及形态观察；比色法检测ALDH活性；Western blot检测HIF-1α及β-catenin蛋白表达（以β-actin为内参）；免疫荧光染色检测干性标志物CD44、SSEA-1及肌动蛋白(F-actin)纤维；数据以均值±标准差表示，两组间比较用非配对t检验，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)加Tukey事后检验，P<0.05为差异有统计学意义。

研究结果

细胞存活与ALDH活性初筛

研究人员先将MCF-7细胞分别暴露于0、50、100 mmHg HP不同时间，发现HP以力和时间依赖性方式增加ALDH活性，结合临床乳腺癌组织HP范围选定50 mmHg进行后续实验。确认50 mmHg HP作用48 h不改变三种细胞形态及存活数，排除增殖或毒性干扰。

HP对干性标志物及ALDH活性的细胞系差异性影响

50 mmHg HP处理48 h后，MCF-7和BT-474细胞中ALDH活性显著升高(P<0.05)，CD44和SSEA-1免疫荧光强度显著增强(P<0.05)；而MDA-MB-453细胞中ALDH活性及干性标志物均无显著变化(P=0.31)。表明HP诱导干性表型依赖细胞系内在特性。

肌动蛋白细胞骨架对HP的响应差异

TRITC-鬼笔环肽染色显示MCF-7和BT-474细胞在HP刺激下形成致密肌动蛋白应力纤维，荧光强度显著升高(P<0.05)；MDA-MB-453细胞呈圆形且未形成致密纤维，荧光强度甚至略降(P=0.27)，提示HP感应可能与细胞骨架重组能力相关，且MDA-MB-453缺乏该机械响应。

HP对HIF-1α及β-catenin表达的影响

Western blot显示50 mmHg HP处理48 h显著上调MCF-7和BT-474细胞中HIF-1α及β-catenin蛋白水平(P<0.05)，而MDA-MB-453细胞中两者均检测不到（与该细胞系β-catenin内源性缺失相符）。提示HP可能经β-catenin上调HIF-1α。

缺氧处理对照实验区分β-catenin的作用

1% O₂缺氧48 h使所有三株细胞（含MDA-MB-453）HIF-1α表达显著升高(P<0.05)、ALDH活性显著升高(P<0.05)，且在MCF-7和BT-474中同时上调β-catenin(P<0.05)。说明缺氧可直接通过HIF-1α诱导干性且不依赖β-catenin；而HP诱导干性需β-catenin作为上游机械传感分子来激活HIF-1α。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，肿瘤组织间液HP升高是一种重要的生物力学微环境因素。本研究证明50 mmHg HP通过Wnt/β-catenin信号上调HIF-1α，进而增强ALDH活性及CD44、SSEA-1表达，促进MCF-7和BT-474乳腺癌细胞获得干性特征；而β-catenin缺陷的MDA-MB-453细胞对HP无响应，却仍可被缺氧通过HIF-1α单独诱导干性，说明β-catenin是HP机械传导所必需但非缺氧化学传导所必需。HP与缺氧均可最终通过HIF-1α促进癌症干细胞样表型，但启动通路不同。研究局限性包括未进行体内实验、未使用三维(3D)球体或患者来源异种移植(Patient-derived xenograft, PDX)模型、未做β-catenin敲低/挽救及HIF-1α抑制的功能验证实验。

综上，研究人员得出结论：肿瘤微环境中升高的组织间液静水压力(HP)可通过β-连环蛋白(β-catenin)增强缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达，从而启动乳腺癌细胞获得干性(Stemness)特征；而缺氧微环境则可通过β-catenin和HIF-1α共同上调加速该过程。靶向特定机械传导分子可能是乳腺癌癌症干细胞干预的潜在治疗策略。