荧光激活细胞分选对公猪精子活力亚群和体外胚胎发育的影响

《Molecular Reproduction and Development》：Effects of Fluorescence-Activated Cell Sorting on Boar Sperm Motility Subpopulations and In Vitro Embryo Development

　　

流动细胞仪分选可用于选择具有特定生理或分子性状的精子亚群；然而，在猪模型中，分选对精子功能及后续胚胎发育的影响尚未明确。本研究旨在评估荧光激活细胞分选（FACS）对公猪精子活力及体外受精（IVF）后发育能力的影响。将混合公猪精液分为分选组和未分选组（对照组），采用计算机辅助精子分析（CASA）在群体水平（常规、群体平均指标）和分选前后采集的单细胞轨迹数据对活力和运动参数进行分析。卵母细胞分别与两组精子受精，评估卵裂（≥2细胞期）和囊胚发育情况。分选组的卵裂率和囊胚率（分别为48.8%±9.9%和8.5%±4.2%）较对照组（分别为92.2%±1.5%和28.4%±2.8%；p<0.001）降低。群体水平CASA显示，精子分选后活力和运动参数存在统计学显著但生物学微小的变化。相反，单细胞CASA结合k-means聚类识别出四个不同的活力亚群，并表明分选重新分配了现有活力状态，其特征是快速前进型精子减少和低能量需求型群体富集。这些发现表明，FACS改变了精子活力亚群的组成，同时导致猪IVF后发育能力显著下降。

## 论文解读：荧光激活细胞分选对公猪精子活力亚群和体外胚胎发育的影响

### 研究背景与目的

辅助生殖技术（ART）在畜牧生产中用于提升繁殖效率和遗传进展。然而，猪体外受精（IVF）系统的受精效率与胚胎发育存在显著变异，其发育能力普遍低于体内来源胚胎。这种变异性部分源于精子群体的异质性——单次射精中的精子在活力、形态和膜组成上存在明显差异，而公猪个体间还存在基因型、季节和品种相关差异。因此，分离并利用最具受精能力的精子亚群成为优化IVF的关键。

荧光激活细胞分选（FACS）作为一种高通量、活细胞兼容的细胞分离技术，已被用于基于DNA含量（性别分选）或分子标志物（如获能状态、线粒体活性）选择精子亚群。然而，分选过程中施加的物理和生化压力（如高压、剪切力）可能影响精子膜稳定性、获能启动、活力和染色质完整性。尽管猪性别分选精子IVF已有报道，但这些研究因分选通量限制而使用了比标准猪IVF低10-20倍的精子：卵母细胞比例（35-75精子/卵母细胞），且未评估分选本身对精子功能异质性的影响。

常规精液分析提供群体平均的活力指标，但掩盖了亚群间的生物学异质性。受精能力被认为集中于不同的精子亚群，而非常规活力指标所能反映。因此，本研究旨在：在标准猪IVF条件下（独立于性别或生物标志物选择），评估FACS过程本身对公猪精子功能和早期胚胎发育的影响，并利用单细胞水平分析阐明活力亚群的重分布。

### 主要技术方法

本研究使用了来自商业Duroc公猪的精液样本。精液采集后利用Preserve Xtreme稀释液运输，于17°C保存3天后使用。每次实验将来自3头公猪的精液等细胞数混合（共4个生物重复用于IVF，10个重复用于活力分析），分成等量分选组和对照组。关键方法包括：以18μM Hoechst 33342对精子进行活细胞DNA染色，使用BD FACSMelody细胞分选仪（100μm喷嘴，流速率10,000 events/s）进行FACS分选（无X/Y门控），收集于含1%BSA的AndroStar Premium长效稀释液中；采用计算机辅助精子分析（CASA，60 fps，最小600细胞/样本）评估群体和单细胞活力参数；应用k-means聚类（k=4）对标准化后的单细胞运动参数（平均路径速度VAP、线性度LIN、侧摆幅度ALH、鞭打频率BCF）进行无监督聚类，识别活力亚群；使用混合线性模型和卡方检验进行统计比较；IVF采用标准mTBM体系，精子最终浓度0.25×10⁶ cells/mL，卵母细胞来自当地屠宰场猪卵巢（3-5mm卵泡），成熟后选择MII卵母细胞进行受精。

### 研究结果

#### 体外受精结果

IVF结果显示，分选精子组（分选组）的卵裂率（48.8%±9.9%）和囊胚率（8.5%±4.2%）均显著低于未分选对照组（分别为92.2%±1.5%和28.4%±2.8%，p<0.001）。分选使卵裂概率降低约93%（OR=0.07），囊胚形成概率降低约81%（OR=0.19）。进一步评估囊胚效率（MII卵母细胞最终形成囊胚的比例），分选组仅为3.4%±1.3%，对照组为26.3%±2.9%，表明分选相关损失在受精、卵裂和卵裂后发育过程中逐步累积。

#### 群体水平运动参数

CASA群体分析显示，总活力、前进活力、前进圆活力、慢速活力在两组间存在统计学显著差异（FDR调整p<0.05或p<0.01），而快速活力无显著差异。在12项详细运动参数中，仅线性度（LIN）和直线性（STR）在分选后显著降低（FDR<0.05）。尽管部分参数达到统计显著性，研究者认为这些变化的生物学幅度较小，不足以解释胚胎发育的大幅下降。

#### 单细胞活力亚群分析

单细胞CASA结合k-means聚类识别出四个活力亚群：快速非直线型、快速前进型、前进型和慢速非前进型。细胞水平卡方检验显示分选显著改变了亚群分布（χ²=111.4，df=3，p<0.0001），标准化残差表明分选组中快速前进型精子减少、前进型精子富集。在线性混合模型分析中，处理×亚群交互效应仅对慢速非前进型亚群显著（p=0.026），分选组该亚群比例升高。t-SNE降维可视化显示分选组与对照组有大量重叠，表明分选未产生新的活力表型，而是在既有活力景观中重新分配细胞。

### 讨论与结论

讨论部分指出，尽管分选诱导了显著的卵裂率和囊胚率下降，但群体水平活力参数变化微弱，提示常规CASA不足以预测分选后的胚胎发育能力。单细胞分析进一步明确，分选改变了活力亚群结构，选择性消耗快速前进型精子并富集低能量需求型亚群，这与先前报道的机械应力、氧化损伤和线粒体扰动机制一致。与早期猪性别分选IVF研究相比，本研究使用了标准精子浓度（约625-714精子/卵母细胞），而非低比例（35-75），因此可能放大了分选诱导的获能样膜变化与多精受精之间的相互作用。与牛IVF系统的趋势一致但猪中发育损伤幅度更大，可能反映了猪卵母细胞对多精受精的高度易感性及分选对精子-卵母细胞互作的干扰。未来研究需量化多精受精率、评估精子与透明带结合能力以及线粒体功能和活性氧水平，并探究公猪个体对分选的敏感性差异。

**研究结论翻译：** 流式细胞分选在引起精子运动学微小变化的同时，损害了猪IVF后的卵裂和胚胎发育。分选精子IVF后卵裂率和囊胚形成的降低总体上与牛IVF系统报告的趋势一致；然而，猪中发育损伤幅度更大，囊胚发育率比牛中通常报道的值低约10%。值得注意的是，先前猪性别分选IVF研究报道分选精子具有相当或更高的卵裂率，但这些研究因当时分选通量限制而使用了比标准猪IVF浓度低10-20倍的精子：卵母细胞比例。本研究发现表明，当分选精子按照标准IVF浓度使用时，FACS处理会损害猪的卵裂和囊胚发育，并通过建立分选相关的单细胞活力亚群重分布与胚胎发育能力之间的机制联系，扩展了先前工作。重要的是，单细胞活力分析揭示分选不产生新的活力表型，而是重新分配现有精子群体，选择性地减少快速前进型精子并富集低能量需求型活力状态。观察到的发育下降可能源于分选过程中诱导的、影响早期胚胎发生的微妙生理或分子改变。鉴于多精受精仍然是许多猪IVF系统的主要障碍，未来研究应确定分选是否损害精子-卵母细胞相互作用及透明带多精受精阻断的建立。