Piper corcovadensis C.DC.（柯氏胡椒）的体外生物活性：抗氧化、抗肿瘤相关及抗菌效应

《The FASEB Journal》：In Vitro Biological Activities of Piper corcovadensis C.DC.: Antioxidant, Antineoplastic-Related and Antibacterial Effects

　　

氧化应激由过量活性氧（ROS）和活性氮（NOX）引起，与退行性、炎症性及癌症相关疾病密切相关。Piper corcovadensis（柯氏胡椒）为南美洲原生植物，以其富含生物活性化合物而著称。该研究采用Folin–Ciocalteu法测定总酚含量（TPC），并通过ABTS、DPPH和FRAP三种方法评估抗氧化活性（AA），同时考察其细胞毒性、抗炎效应及抗菌活性。细胞毒性采用MTT法在SK-MEL-28黑色素瘤细胞上进行评估；氧化应激生物标志物（ROS、NOX）、蛋白巯基（PSH）和非蛋白巯基（NPSH）以及炎症介质（NLRP3、IL-6、TNF）通过RT-qPCR在50、500和5000 μg mL^-1浓度下进行分析。抗菌活性针对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium），采用最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）进行评估。结果表明，该提取物TPC为11.64 mg GAE g^-1，抗氧化活性分别为33.15 mM Trolox g^-1（ABTS法）和21.27 mM Trolox g^-1（DPPH法）。在500和5000 μg mL^-1浓度下，提取物可降低SK-MEL-28细胞活力，并减少ROS、NOX和PSH水平；在5000 μg mL^-1浓度下，可下调NLRP3和IL-6表达，同时上调TNF表达。对所有测试菌株的MIC和MBC均大于5 mg mL^-1，在所测浓度下未显示抗菌活性。然而，Piper corcovadensis提取物表现出显著的体外生物活性，尤其在抗氧化能力、氧化应激标志物调控及黑色素瘤细胞活力影响方面。

该论文发表于《The FASEB Journal》，旨在探究南美洲原生植物Piper corcovadensis（柯氏胡椒）乙醇提取物的多种生物活性，包括抗氧化活性、对黑色素瘤细胞活力的影响、炎症标志物调控及抗菌活性。

研究背景方面，氧化应激在多种疾病的发病机制中扮演关键角色，包括阿尔茨海默病、炎症、动脉粥样硬化和癌症等。活性氧（ROS）作为有氧代谢的自然副产物，在过量积累时会超越内源性抗氧化防御系统，导致氧化应激状态，进而引发细胞水平的氧化损伤。黑色素瘤作为一种与氧化应激密切相关的高度侵袭性皮肤癌，其全球发病率持续上升，而传统化疗、放疗和免疫疗法虽为主流策略，但植物来源的生物活性化合物因其抗氧化、抗炎和抗菌特性而展现出良好的替代治疗潜力。Piper corcovadensis（柯氏胡椒）在当地传统医学中被用于治疗感冒、流感、牙痛和肺结核，其精油已被报道具有抗氧化、抗菌和细胞毒性作用，但乙醇提取物的生物活性化合物在 therapeutic applications 方面尚待深入探索。基于此，研究人员开展了这项研究。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：提取物的制备与表征（基于先前优化的乙醇/水提取工艺）、体外抗氧化活性评估（Folin–Ciocalteu法测定总酚含量，ABTS、DPPH和FRAP三种互补方法评估抗氧化能力）、细胞活力检测（MTT法在SK-MEL-28皮肤黑色素瘤细胞上进行，并以健康供体外周血单个核细胞PBMCs作为非肿瘤细胞对照；荧光显微镜检测TMRE和DAPI荧光强度）、氧化应激生化参数分析（荧光法测定细胞内ROS、Griess法测定亚硝酸盐/硝酸盐水平、DTNB法测定PSH和NPSH）、炎症标志物表达分析（RT-qPCR检测NLRP3、IL-6和TNF基因表达，以内参基因GAPDH标准化），以及抗菌活性评估（按照CLSI指南测定MIC和MBC，测试菌株包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌）。

研究结果部分：

3.1 酚类化合物与抗氧化潜力评估：该部分通过ABTS、DPPH和FRAP三种互补方法评估了提取物的抗氧化潜力。结果显示，总酚含量为11.64 ± 0.044 mg GAE g^-1；ABTS法测得抗氧化活性为33.15 ± 11.66 mM TE g^-1，DPPH法为21.27 ± 0.535 mM TE g^-1，FRAP法为13.47 ± 1.37 mM Fe²⁺ g^-1。这些数值与同属其他物种如Piper auritum和Piper chaba的研究结果具有可比性，表明确实具有胡椒属植物典型的酚类化合物特征。

3.2 Piper corcovadensis提取物对黑色素瘤细胞活力及非肿瘤细胞毒性的影响：通过MTT法检测发现，50 μg mL^-1浓度对SK-MEL-28细胞活力无显著影响，但500 μg mL^-1显著降低细胞活力（p < 0.001），5000 μg mL^-1进一步降低（p < 0.0001）。荧光显微镜结果支持上述发现：DAPI荧光强度从500 μg mL^-1开始显著降低，TMRE检测的线粒体膜电位（ΔΨm）在50 μg mL^-1即出现显著下降，5000 μg mL^-1时完全丧失。值得注意的是，相同浓度处理24小时后，健康供体PBMCs的细胞活力未受显著影响，提示提取物对肿瘤细胞具有选择性毒性。这一结果与此前该植物精油的研究结果一致。

3.3 细胞内ROS、亚硝酸盐/硝酸盐、PSH和NPSH水平：该部分通过多种生化检测方法分析了氧化应激参数。结果显示，ROS水平在5000 μg mL^-1时显著降低（p < 0.0001）；亚硝酸盐/硝酸盐水平在50 μg mL^-1时显著降低（p < 0.01），500 μg mL^-1时亦有降低（p < 0.05），但5000 μg mL^-1时与对照无显著差异；PSH在5000 μg mL^-1时降低（p < 0.05），而NPSH在各浓度下均无显著变化。研究人员解释，PSH在ROS和NOX存在下可被氧化为PS-SR（氧化型硫醇或二硫化物），其水平降低与ROS、NOX水平降低相一致，反映细胞氧化应激状态的改变。

3.4 RT-qPCR检测炎症谱：该部分针对5000 μg mL^-1浓度（此浓度下SK-MEL-28细胞活力降低最为显著）分析了炎症相关基因表达。结果显示，NLRP3表达显著下调（p < 0.05），IL-6表达亦显著降低（p < 0.05），而TNF表达相对对照组显著上调（p < 0.05）。研究人员指出，NLRP3激活可驱动IL-6等促炎细胞因子的产生，而IL-6与肿瘤微环境密切相关；TNF的上调可能与观察到的黑色素瘤细胞活力降低有关，因其可诱导细胞凋亡。

3.5 抗菌活性：该部分评估了提取物对四种食源性病原菌的MIC和MBC。结果显示，对所有测试菌株，MIC和MBC均大于5 mg mL^-1，在所测浓度范围内未观察到抗菌活性。研究人员指出，更高浓度的提取物可能展现抗菌效果，并援引了同属其他物种如Piper nigrum具有更强抗菌活性的文献。

讨论部分总结：研究人员强调，该提取物在相对较高浓度下才显现显著效应，这在粗提物研究中较为常见，突显了进一步分馏和鉴定活性化合物的必要性。提取物对黑色素瘤细胞的选择性毒性（不影响PBMCs活力）具有重要价值。氧化应激标志物的改变提示提取物可能干扰细胞氧化还原稳态，而NLRP3、IL-6和TNF表达的调控则表明其涉及炎症信号通路的相互作用。抗菌活性方面，由于浓度限制未能确定具体MIC和MBC数值。总体而言，该研究为Piper corcovadensis的生物活性提供了体外实验证据，但尚需化合物分离、机制研究及体内实验等后续工作以深入理解其生物学效应和潜在应用价值。

研究结论翻译：该研究结果表明，在评估的实验条件下，Piper corcovadensis提取物具有体外抗氧化活性，能够调控氧化应激和炎症标志物，并影响黑色素瘤细胞活力。在细胞毒性方面，该提取物以浓度依赖性方式降低SK-MEL-28细胞活力，而对PBMCs未观察到显著毒性。然而需要强调的是，产生显著效应所需的浓度相对较高，这在粗提物研究中较为常见，也凸显了进一步分馏和鉴定活性化合物的必要性。氧化应激标志物的调控结果显示ROS和NOX水平降低，同时伴有硫基防御系统的改变。这些发现表明该提取物可能干扰细胞氧化还原稳态。此外，NLRP3、IL-6和TNF表达的调控提示其可能通过炎症信号通路的相互作用参与黑色素瘤细胞活力的降低过程。Piper corcovadensis提取物对所测试的所有细菌均未显示出抗菌活性，在测试浓度范围内未能确定MIC和MBC数值。未来需要开展化合物分离、机制研究及体内实验等进一步研究，以更好地理解该物种的生物学效应和潜在应用。