《Physiologia Plantarum》：Ice Nucleation and Freezing Consequences in Perennial Plants
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冰在植物体内的成核位置决定了其对细胞、组织和器官等不同生物区室产生的物理约束，因此明确冰成核的位置与机制是预测低温伤害程度的核心前提。一方面，胞外结冰可通过水分外排提高胞内渗透调节物质浓度，降低胞内冰点，从而对活细胞产生保护作用；另一方面，结冰诱导的过度脱水可
冰在植物体内的成核位置决定了其对细胞、组织和器官等不同生物区室产生的物理约束，因此明确冰成核的位置与机制是预测低温伤害程度的核心前提。一方面，胞外结冰可通过水分外排提高胞内渗透调节物质浓度，降低胞内冰点，从而对活细胞产生保护作用；另一方面，结冰诱导的过度脱水可能导致质膜损伤与破裂。植物体内冰形成的位置与模式具有高度的时空异质性，受组织类型、发育阶段及初始冰核性质的共同调控。本综述聚焦多年生植物中固有冰成核及其后续扩展的机制与动态过程，系统阐述了影响冰成核的关键因子，包括成核剂性质与其他生物物理条件。研究人员同时指出了当前植物结冰研究的局限性，尤其是实验室研究的不足，强调需采用跨学科方法深入探究植物冰成核过程，并为该领域的新研究者提供了实用的实验工作流程。
1 引言
低温尤其是零度以下温度是限制植物发育与存活的关键环境因子，直接决定物种的海拔与纬度分布格局及农业产量。结冰通过诱发细胞与水力损伤产生冻害，但霜冻事件（气温降至零度以下）并不必然导致结冰（水的物相转变）。气候条件（风、湿度、温度）通过决定霜冻类型（平流霜冻或辐射霜冻）定义霜冻灾害风险，地形、土壤特征与植被覆盖则通过形成局地温度梯度与器官温度决定霜冻暴露程度。植物结冰还受冰核存在的调控，冰通常围绕粒子起始并在组织中扩展，但现有霜冻风险研究常仅将伤害与霜冻暴露和气象灾害关联，普遍忽视冰核的作用。
结冰发生的温度与速率影响冻害强度，进而决定致死温度阈值。冰成核的负面效应主要分为两类：一是细胞损伤，当脱水与复水过程过于剧烈或快速，或发生胞内结冰时产生；二是水力破坏，由冰中气泡形成及融解时扩张导致的气体栓塞引发。胞内结冰会直接破坏细胞膜结构，造成不可逆的细胞死亡，宏观层面表现为组织软化、枯梢与畸形，降低繁殖成功率并影响生物量生产。
植物抵御霜冻的策略分为避冻与耐冻两类。避冻策略包括通过种子或地下器官避开冬季严寒，或通过过冷作用使水在负温下维持亚稳态液相；耐冻则是经低温驯化的植物允许胞外结冰，通过水势差驱动胞内水分向外扩散并结冰，此过程释放潜热，同时胞内溶质浓度升高，若脱水过强会导致细胞器与生物大分子的渗透胁迫。耐冻植物细胞通过维持质膜流动性、增加溶质含量保护分子与细胞结构，质膜组成（水通道蛋白、不饱和脂肪酸）保障冻时水分外排与融时回吸，质膜与细胞壁则通过亲水性分子（磷脂、糖蛋白、半纤维素与果胶）的黏附作用调控冰的形成与扩展。
植物生理状态的季节变化会影响冰成核活性（INA），但目前机制尚不清晰，阻碍了冻害风险的精准预测。植物甚至可能在低霜冻暴露期采用避冻策略、寒冷期转为耐冻策略。气候变化背景下，温带地区冬季条件改变导致晚霜风险上升，正深刻影响植物冻害响应的季节性规律，亟需开展跨尺度研究。
2 结冰的物理化学基础
2.1 冰成核的基本机制
冰形成源于水分子组织形成初始“临界”冰核，热力学条件适宜时冰会发生不可逆生长并扩展为更大晶体结构。水分子自发聚集成临界冰核可通过体相水中密度与取向的随机涨落实现，也可由催化表面辅助完成。纯水中近-39°C时仅需约70个水分子即可形成可生长的临界冰晶，而在-5°C时则需45000个分子，凸显过冷现象的存在。在多年生植物的自然生存环境中，水分子自发形成有效初始冰晶的概率极低，因此霜冻事件中植物组织的冰触发主要依赖异质冰核：与植物组织内外水分接触的固体物质，可降低晶体扩展的能量壁垒。理论上单个冰核足以冻结连续水体，但实际中多个独立成核事件可同时发生。冰成核的温度取决于成核位点的分子表面尺寸、形状与疏水性等性质，已知多种惰性及生物材料具有冰成核能力，包括长石（矿物尘）、纤维素、花粉及硅藻、真菌、细菌（尤其是丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae）等，其中丁香假单胞菌的INA可达-2°C，显著高于木质素（-18°C）与纤维素（-21°C）。
冰核通过降低液-固相变活化能垒促进异质结冰，其有效性取决于对水分子氢键（偶极）的定向能力，而非传统的晶格匹配理论。除温度与冰核外，组织内溶质浓度与性质也显著影响异质冰成核：溶质通常会降低平衡冰点，但其作用并非仅由渗透势决定，还可根据化学性质激活或失活成核位点。冰晶从初始核扩展时，非水组分会被排除至周围液相，形成强渗透梯度并驱动水与溶质通量，冻融过程中这些通量会通过快速改变细胞膨压造成损伤，因此水通道蛋白在低温保护中发挥关键作用。
2.2 植物固有冰核的冰成核活性
植物组织内部或表面均存在冰核，分别引发内部或外部冰成核。固有冰核是植物自身产生或衍生的物理颗粒，需区分冰核（引发成核的粒子）与冰成核活性（INA，描述组织中异质冰成核过程的温度指标）。相较于丁香假单胞菌等外源冰核，植物固有冰核的研究仍较匮乏，其产生与植物的冻害策略直接相关：高INA通常与耐冻策略相关，低INA（更低的结冰温度）则多为避冻策略的体现，其季节动态（丰度、性质、位置变化）决定了植物采用的耐冻机制。
固有冰核的化学性质与精确分布仍难以阐明，目前已鉴定的包括黑麦中的一种蛋白质、多肉植物与花粉中的多糖、草本植物的淀粉粒及木质素等，但多数情况下冰核可能具有物种特异性、季节变异性与生命周期依赖性，且热稳定性存在组织差异。实验上植物INA通常通过浸没冻结法测定，但该方法无法区分外源与固有成核。抗生素处理或高压灭菌后仍存在约-1°C至-2°C的“残留”INA，提示固有冰核的存在，但结果仍存在歧义，因细菌碎片或蛋白可能保持活性。未来研究需开发固有冰核的分离与鉴定方法，结合热处理、过氧化氢消解、靶向化学或酶处理区分有机与无机成分，并通过冻融循环与液滴细分技术结合结晶学、偏光与共聚焦显微镜等手段揭示其特性。
3 易损组织的保护：冰屏障的作用
冰成核后限制其在植物体内的扩展对存活至关重要，冰扩展速率可达24 cm·s-1，受扩展方向、过冷度、组织与物种调控。冰扩展可被抗冻蛋白（AFPs）等分子抑制，也可通过屏障的存在或特定区域的成核促进实现，屏障可分为三类：热屏障作用于植株与器官尺度，通过土壤耦合、积雪隔热、单株微气候温度梯度实现，如高寒垫状植物可利用土壤储热阻止夜间霜冻时冰向基部扩散，春季球根植物的温暖土壤可阻断地上部冰向地下器官蔓延；物理屏障作用于植株、器官、组织与细胞尺度，包括复杂的芽鳞结构、不透水的角质层、茎/芽内的解剖屏障、临时性水力断开、特化木质部屏障、器官外结冰、质膜与细胞壁，如云杉的芽鳞结构与桤木芽鳞的亲脂物质（三萜类与黄酮苷元）可阻止外部冰侵入，叶片毛状体可将成核重定向至表皮毛，维持隔热空气层，角质层通常不透冰，疏水性颗粒膜可增强对外源成核的防护；化学屏障作用于细胞与组织尺度，包括抗冻蛋白、钙离子介导的去甲基酯化同型半乳糖醛酸聚糖、亲脂性物质。越冬芽与生殖器官对冰极度敏感，茎中位于营养芽下方的特化组织可作为物理屏障，其特征包括原维管束（无木质部连接）、小而紧密的无液泡厚壁细胞、干燥区域、细胞壁酚类物质（栓质与木质素）与未酯化果胶沉积，可降低细胞壁孔径使水无法结冰，若存在完整木质部连接则纹孔孔径会缩小，冬季临时性水力断开也会成为茎与芽间的屏障，春季水力连续性恢复则移除屏障。物理屏障的核心是限制冰在特定区域形成，通过“器官外结冰”或“组织外结冰”保护易损器官，冰在芽周间隙、芽鳞间或叶柄表皮与薄壁组织间形成，通过抽吸水减少机械应变，防止胞内结冰；细胞尺度上质膜与细胞壁作为耐冻细胞的胞外冰屏障，细胞壁中果胶交联与钙离子介导的果胶修饰参与冰保护。
4 组织特异性冰成核与结冰过程的季节动态
4.1 木质部冰成核的后果
木质部作为质外体输水网络，低溶质浓度与大体积水使其冰成核概率较高，且冰易在其中扩展。胞外结冰会因冰与水势（Ψ）的差异产生指向冰锋的水驱动力，驱动茎内显著的水分通量，根据克劳修斯-克拉佩龙关系，特定温度下冰的Ψ极低，温度每降低1 K，活细胞将经历1.16 MPa的水势下降，导致显著脱水，树皮细胞与木质部薄壁细胞的胞内水向胞外腔隙扩散，使茎收缩（树皮约占70%，木质部约占30%）。当超过临界低温阈值时，冻结木质部汁液可通过胞质皱缩（结冰诱导脱水）或胞内结冰损伤活细胞；冻融过程还会导致木质部栓塞与输导功能丧失，因溶解于木质部汁液中的气体不溶于冰，会在融解时扩张填充导管，气泡的命运（溶解或扩张栓塞）取决于融解时周围木质部汁液的水势与气泡大小，导管越大冬季栓塞易发性越高，树木水分状况与冻融循环次数也会影响栓塞风险。
4.2 植物水分状况对跨季节结冰过程的影响
夏季未驯化的树木水分充足、溶质浓度低，冰成核阈值较高，突降温易导致严重细胞损伤；冬季驯化后树木含水量降低、溶质浓度升高，渗透势降低，胞内结冰阈值下降。质外体结冰受植物水分状况调控，木质部水势可分解为向上输水的物理负压与溶质产生的渗透势，渗透贡献通过降低熔点发挥作用，类似道路撒盐融雪；负压理论上应升高熔点，但现有证据表明其作用相反，可能水势本身通过未知机制发挥抑冰作用。负压还可驱动气泡通过纹孔从栓塞导管进入充水导管并产生声发射，这些气泡可能成为进一步栓塞或冰成核的种子，也可能仅向上运输气体，低水势会提升冻前（气泡更多更大）与融时（气泡难重溶）的栓塞风险。若无其他固有成核剂，木质部导管壁可能催化结冰，该过程会被气泡抑制，使其成为潜在的抑冰因子，但不同类型气泡的特性仍有待明确。未来需结合质谱与原子力显微镜等高精度技术研究木质部汁液的代谢物组成与木质部壁的纳米级表面特征，并修订内聚力-张力理论以纳入多相体系的影响。
4.3 从茎到芽：季节转换与组织特异性冰成核
理解多年生植物冰形成与扩展需整合时空视角，考虑组织差异与季节变化。分生组织（芽、形成层）与生殖结构（花、果）的脆弱性随INA与抗冻性（CH）变化而改变，对应生长季向休眠期（芽分化、生长停止与内休眠诱导）及休眠期向生长季（生态休眠解除）的生理转换，与水分状况、糖分积累及冰屏障建立密切相关。
枝干尺度上，木质部与韧皮部的响应存在差异，如白桦中相同成核温度（-3°C）下木质部脱驯化更快、损伤更高，葡萄中木质部比韧皮部更耐寒，后者脱驯化伴随可溶性糖降低与含水量升高。木本茎的冰成核始于最幼嫩木质部或形成层-韧皮部区域，并快速向全茎扩展。形成层作为次生分生组织常被归入树皮或韧皮部，其休眠期液泡缩小、脱水，损伤会导致枝条死亡，春季韧皮部活化与形成层生长恢复输导功能与组织再生，因此分生组织区的CH动态对预测冻害与恢复至关重要。
芽与花器官中，分离的器官原基比完整芽的INA更高，被子植物生殖芽的不同花器官INA差异显著，如杏花的花托INA为-1.9°C至-11.7°C，雌蕊为-6.6°C至-17.0°C，但完整梨花中冰通常始于萼片与花托并向全花扩展，花器官脱驯化与子房复水（相对含水量与体积变化）相关。离体组织的INA测定无法反映整株尺度的水分移动，需结合田间原位研究。
5 超越实验室的冰成核测定
评估植物组织冰成核的影响因素需注意实验室与田间研究的差异、采样策略及避免人工过冷。田间研究显示冰通常在植物最冷部位成核，若整株低于0°C且无内部冰屏障，单次成核事件即可引发全株胞外结冰，若存在温度与INA异质性也可观察到独立成核。云杉中从基部向远端扩展的模式可能与分枝处的优先成核位点或木质部导管扩大有关，全树冻结可在1小时内完成，冰扩展速率受过冷度、水分状况与栓塞程度影响。双子叶植物中冰一旦接触木质部汁液即通过木质部纵向扩展至全株，随后以较低速率径向与切向扩展至其他组织；禾草类则不同，各叶独立成核，因叶间维管无连接或存在茎基部热屏障。
田间与实验室离体枝的结冰温度存在显著差异，如 intact 苹果树田间成核温度为-1.9°C，实验室仅为-4.6°C，多数树种田间成核温度为-0.6°C至-2.6°C，草本、蕨类与棕榈叶片不低于-4.3°C，柠檬树例外可达-3.5°C至-7.7°C，且更耐寒、更频繁暴露于霜冻的物种实际成核温度更高。影响成核温度的主要因素包括：样品大小，冰成核温度与鲜重呈对数关系，小样品可人工过冷至-10°C以下，大样品因含更多冰核而成核温度更高；暴露时长，恒定亚零温度下暴露越久成核概率越高，尤其对冰敏感植物；降温类型，田间多为辐射霜冻（植物表面因长波辐射散热低于气温），实验室多为对流降温（植物接近或高于气温），两者环境差异显著。
实验室需避免人工过冷，否则会高估CH。模拟自然成核首先需明确研究物种与器官的田间原位成核温度，通过检测冰潜热释放的方法（热电偶、红外热成像）观测；降温速率应模拟自然条件（1–3 K·h-1），过快会导致成核温度偏低；小样品需在自然成核温度范围内人工诱导成核，可使用生物成核剂（如商品化的Snomax）或冰接种技术。准确识别冰在组织中的位置对区分避冻与耐冻策略至关重要，共聚焦显微镜结合冷却系统与偏光技术可实现高分辨率冰检测，磁共振成像（MRI）通过检测水分迁移监测冰锋扩展，但因成本与机时限制应用较少。研究需优先把握整株视角与田间结冰行为，再开展离体器官研究。
6 结论与未来方向
植物冰成核是复杂过程，样品大小与解剖连续性对冰起始与扩展至关重要，分割植物材料会扭曲自然结冰动态，需发展融合多学科的实验方法，反映真实成核条件。未来研究应聚焦两大方向：一是明确固有冰核的分子本质、调控机制及其与CH和气候条件的互作，从遗传与细胞层面解析其激活与抑制机制；二是阐明气泡形成与冰成核过程的耦合关系，明确气泡大小对栓塞风险的调控因素，提升冻害水力失败的预测能力。作物抗冻适应策略应包括田间降低INA的管理措施与关键脆弱性状的遗传控制：外源冰核主导时可应用临时抑冰剂（如疏水产品），固有冰核主导时则需依靠遗传选育，减少固有成核剂数量、增强冰扩展物理屏障、优化物候节律避开晚霜。需结合地形微气候开展多物种研究，融合植物生理、解剖、物理与微气候的整合方法，是缓解辐射与平流霜冻损害的核心路径。
