《Phytotherapy Research》：Dehydrocostus Lactone Suppresses Hepatocellular Carcinoma by Inhibiting Protein Tyrosine Kinase-7 Mediated β-Catenin Signaling
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去氢木香内酯（Dehydrocostus lactone，DHL）是一种从木香（Aucklandia lappa，Radix Aucklandiae）中分离得到的倍半萜内酯，是一种生物活性化合物，因其抗炎和抗肿瘤特性而广泛用于传统医学。然而，其在肝细胞癌（he
去氢木香内酯（Dehydrocostus lactone，DHL）是一种从木香（Aucklandia lappa，Radix Aucklandiae）中分离得到的倍半萜内酯，是一种生物活性化合物，因其抗炎和抗肿瘤特性而广泛用于传统医学。然而，其在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中的精确分子靶点和药理机制仍 largely undefined。本研究旨在阐明蛋白酪氨酸激酶7（protein tyrosine kinase 7，PTK7）在HCC中的作用，并研究DHL作为PTK7靶向化合物抑制β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的抗肿瘤功效和机制。研究人员整合了单细胞转录组数据和空间转录组数据，以及公开的TCGA-LIHC和GEO数据集，以确定PTK7在HCC中的表达模式和通路关联。进行了细胞增殖、凋亡、线粒体膜电位和侵袭实验以评估DHL活性。进行了分子对接、细胞热转变分析（cellular thermal shift assay，CETSA）、药物亲和力响应靶标稳定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）测定和免疫共沉淀测定，以确认DHL直接抑制PTK7与β-catenin的相互作用。在Hep3B和Huh7异种移植模型中评估了DHL的体内抗肿瘤功效。PTK7在恶性HCC细胞中高表达，并与β-catenin通路激活正相关。DHL处理破坏了PTK7–β-catenin相互作用，抑制了增殖，诱导线粒体依赖性凋亡，并通过下调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和MMP-9减少侵袭。DHL还以剂量依赖性方式降低了蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和β-catenin的磷酸化。CETSA和DARTS测定证实了DHL对PTK7的直接抑制。在体内，DHL显著抑制肿瘤生长，在Hep3B和Huh7异种移植模型中分别达到约34%–54%和28%–58%的抑制率。DHL通过直接靶向PTK7并抑制β-catenin信号传导在HCC中发挥显著的抗肿瘤作用。这些发现确定PTK7为潜在的治疗靶点，并支持将DHL开发为用于PTK7定向HCC治疗的有前景的天然药物。
**论文解读：去氢木香内酯通过靶向蛋白酪氨酸激酶7抑制β-连环蛋白信号治疗肝细胞癌**
**研究背景与问题**
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第三大癌症死亡原因，现有治疗手段（如肝切除、局部消融、肝移植、靶向治疗和免疫治疗）虽已改善总体生存，但临床疗效仍有限，主要归因于晚期诊断及内在或治疗获得性耐药。因此，亟需识别新药靶点并开发新型治疗药物。蛋白酪氨酸激酶7（protein tyrosine kinase 7，PTK7）是一种位于6p21.1染色体上的催化失活受体酪氨酸激酶样蛋白，其过表达在HCC中与侵袭性表型、增强转移能力和不良预后密切相关。PTK7直接与β-连环蛋白（β-catenin）相互作用，调节Wnt/β-catenin信号通路，但PTK7-β-catenin相互作用在HCC中异常信号的确切分子机制仍不完全清楚。去氢木香内酯（dehydrocostus lactone，DHL）是从传统中草药木香（Aucklandia lappa）中分离的倍半萜内酯，已知具有抗炎和抗肿瘤活性，但其在HCC中的抗肿瘤效应及机制尚不明确。本研究旨在系统探讨PTK7在HCC中的作用，并评估DHL作为靶向PTK7-β-catenin相互作用的候选天然化合物的潜力。
**主要技术方法**
研究人员整合了公开数据集（包括来自GEO的GSE166635单细胞RNA测序数据、PRJCA003792-HRS119117空间转录组数据、TCGA-LIHC和GSE39791等多转录组数据集）用于表达模式分析。通过分子对接预测DHL与PTK7的结合，并采用细胞热转变分析（CETSA）、药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）及免疫共沉淀实验验证直接相互作用。使用PTK7-HaloTag与NanoLuc-β-catenin融合蛋白构建荧光素酶报告系统进行化合物筛选。细胞功能实验包括CCK-8活力、集落形成、Annexin V-FITC/PI双染流式凋亡、JC-1线粒体膜电位及Matrigel Transwell侵袭实验。Western blot检测信号通路蛋白。在BALB/c裸鼠皮下异种移植模型（Hep3B和Huh7）中评估体内抗肿瘤效力。所有细胞系（Hep3B和Huh7）均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
**研究结果**
1. **PTK7在恶性HCC细胞中富集并与β-catenin通路激活相关**：单细胞RNA测序（GSE166635）UMAP聚类及AUCell评分显示，β-catenin通路活性在恶性细胞中高于基质细胞。空间转录组（PRJCA003792-HRS119117）显示PTK7表达主要定位于恶性区域。TCGA-LIHC和GSE14520队列中，PTK7 mRNA在肿瘤组织中高于正常组织，且高表达患者生存期更短。基因集富集分析（GSEA）证实PTK7高表达样本中β-catenin信号通路显著富集。
2. **DHL体外抑制HCC细胞增殖**：基于PTK7-β-catenin报告系统筛选约1000种天然化合物，DHL显著抑制荧光信号（log
2 倍变化约-1.2）。CCK-8实验显示DHL以浓度依赖性方式降低Hep3B和Huh7细胞活力（16 μM时活力降至8%–13%）。集落形成实验显示DHL在1–8 μM范围内剂量依赖性减少集落数量（最高浓度近完全抑制）。
3. **DHL诱导HCC细胞凋亡**：Annexin V-FITC/PI流式显示，DHL（2–8 μM）浓度依赖性地增加凋亡细胞比例（Hep3B从1%增至38%，Huh7从1%增至38%）。Western blot证实cleaved caspase-3水平显著上调。
4. **DHL诱导伴随线粒体功能障碍的凋亡**：JC-1染色显示DHL浓度依赖性地降低线粒体膜电位（ΔΨm），红/绿荧光比值在Hep3B中从约4.2降至0.7，Huh7中从约3.8降至0.9。Western blot显示Bax/Bcl-2比值显著升高（Hep3B中2 μM时约35倍，Huh7中约50倍）。
5. **DHL抑制HCC细胞侵袭并降低MMP表达**：Transwell实验显示DHL（0.5–2 μM）浓度依赖性地抑制Hep3B和Huh7细胞侵袭（2 μM时降至<10%）。Western blot显示MMP-2和MMP-9蛋白表达显著下降。
6. **DHL抑制AKT/ERK/β-catenin信号通路激活**：Western blot显示DHL（2–8 μM）浓度依赖性地降低p-AKT/t-AKT、p-ERK/t-ERK和p-β-catenin/t-β-catenin比值，同时减少β-catenin下游靶标c-Myc蛋白表达。
7. **DHL直接结合并稳定PTK7蛋白**：分子对接显示DHL以-8.0 kcal/mol结合能稳定结合PTK7激酶结构域（关键残基Lys830）。CETSA和DARTS实验证实DHL处理显著增强PTK7热稳定性和抗蛋白酶降解能力。免疫共沉淀显示DHL（8 μM）减少PTK7与β-catenin的结合。PTK7过表达部分减弱DHL对ΔΨm的影响。
8. **DHL体内抑制HCC异种移植瘤生长**：在Hep3B和Huh7裸鼠模型中，DHL（5和10 mg/kg，腹腔注射，每周3次，15天）剂量依赖性地抑制肿瘤生长，抑制率分别为~34%–54%和28%–58%。5-氟尿嘧啶（10 mg/kg）阳性对照抑制率约87%和78%。免疫组化显示DHL降低Ki-67表达。体重及主要脏器H&E染色未见明显毒性。
**讨论与结论**
研究表明，PTK7在HCC恶性细胞中特异性高表达且与β-catenin通路激活及预后不良相关，提示其作为治疗靶点的潜力。DHL通过直接结合PTK7并破坏其与β-catenin的相互作用，而非直接抑制β-catenin本身，从而削弱β-catenin信号输出，避免全身性抑制该通路带来的毒性。DHL处理伴随AKT/ERK和β-catenin信号磷酸化水平下降，但作用模式聚焦于PTK7调控节点。体内实验证实DHL在有效剂量下无明显全身毒性。结论：PTK7是HCC中关键致癌介质，DHL作为靶向PTK7的小分子抑制剂，通过抑制β-catenin驱动的肿瘤进展发挥抗肿瘤作用，为HCC治疗提供了新的干预策略。
