银杏黄酮类化合物生物合成中GbMYB15作为负调控因子的鉴定与功能分析

《Plant Physiology and Biochemistry》：Identification and functional analysis of GbMYB15 as a negative regulator in flavonoid biosynthesis of Ginkgo biloba

　　

黄酮类化合物（flavonoids）具有多种药理活性，在银杏（Ginkgo biloba）叶片中含量丰富，有助于预防心脑血管疾病。R2R3-MYB转录因子（transcription factors）是黄酮类代谢（flavonoid metabolism）的关键调控因子，然而它们在银杏中的功能，特别是涉及负调控（negative regulation）的功能，仍知之甚少。在本研究中，基于初步转录组数据，研究人员克隆了一个与黄酮类生物合成（flavonoid biosynthesis）相关的基因GbMYB15。通过生物信息学分析、银杏中的瞬时过表达以及拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的稳定异源表达，对其功能角色进行了探究。结果表明，GbMYB15蛋白含有一个C1活化基序（activation motif）。在外源ABA和MeJA处理下，GbMYB15的表达水平与总黄酮含量呈负相关。在拟南芥和银杏中过表达GbMYB15显著降低了总黄酮含量，证实GbMYB15是总黄酮合成的负调控因子。此外，酵母双杂交（yeast two-hybrid）、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）和荧光素酶互补成像（luciferase complementation imaging, LCI）实验确认GbMYB15与能量代谢相关蛋白Gb34759发生互作。在银杏叶片中的瞬时过表达实验进一步显示，GbMYB15与Gb34759的互作增强了GbMYB15的负调控能力。双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assays）表明，GbDFR2是GbMYB15在黄酮类生物合成中可能调控的下游候选结构基因。基于这些结果，本研究提出一个调控模型：GbMYB15可能通过调控GbDFR2关联途径的代谢流（flux）影响总黄酮含量，且GbMYB15与Gb34759的互作可能增强了这一调控效应。这项工作为未来旨在提高银杏黄酮含量的基因工程提供了理论基础。

**研究背景、现存问题与研究目的**
银杏（*Ginkgo biloba*）是一种原产于中国的古老树种，其叶片富含黄酮类化合物（flavonoids），具有心血管保护、认知增强和抗肿瘤等多种药理活性。标准化银杏叶提取物（GBE）中约含24%的黄酮类化合物，被视为关键活性成分。然而，自然来源的黄酮产量有限，难以满足日益增长的市场需求，因此通过遗传手段调控黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）以促进其积累成为重要研究方向。
黄酮类化合物的生物合成途径已被广泛研究，其调控主要由结构基因（structural genes）和转录因子（transcription factors）介导。在众多转录因子家族中，R2R3-MYB亚家族是调控黄酮代谢的核心因子。银杏中已鉴定出多个正调控因子（如GbMYBFL、GbMYB1、GbMYB11、GbMYB36、GbMYB41）和负调控因子（如GbMYBF2、GbMYBR1）。尽管大多数结构基因已被发现，但R2R3-MYB因子负调控的分子机制仍不明确。基于研究组前期转录组数据，研究人员选择了基因GbMYB15进行功能鉴定，旨在通过同源和异源转化系统阐明其作用，揭示银杏中的调控机制，为药用代谢物谱的遗传工程提供理论框架。

**研究开展内容、结论与意义**
研究人员克隆了GbMYB15，通过生物信息学分析、银杏瞬时过表达和拟南芥稳定异源表达，证实GbMYB15是总黄酮合成的负调控因子。酵母双杂交、双分子荧光互补和荧光素酶互补成像实验确认GbMYB15与能量代谢相关蛋白Gb34759互作，且共表达增强负调控能力。双荧光素酶报告实验表明GbDFR2是下游候选靶基因。研究提出调控模型：GbMYB15可能通过调控GbDFR2途径的代谢流影响总黄酮含量，且与Gb34759的互作增强该效应。该研究为理解黄酮生物合成的负调控机制提供了实验与表型证据，并为通过基因工程提高银杏黄酮含量提供了潜在关键靶点和理论基础。论文发表在《Plant Physiology and Biochemistry》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：①基于银杏基因组数据库克隆GbMYB15的编码序列（CDS），并利用ExPASy ProtParam预测蛋白理化性质，PlantCARE分析启动子顺式作用元件；②通过农杆菌介导的瞬时转化系统在一年生银杏叶片中过表达GbMYB15（对照为空载体），并在拟南芥（Columbia生态型，Col）中通过花序浸染法进行稳定异源表达（T3代纯合系）；③采用HPLC法测定总黄酮含量（银杏以槲皮素+山奈酚+异鼠李素×2.51×稀释因子计算，拟南芥同法）；④酵母双杂交（Y2H）筛选银杏cDNA文库鉴定互作蛋白Gb34759，并通过BiFC（在烟草叶片中观察YFP信号）和LCI验证互作；⑤双荧光素酶报告实验验证GbMYB15对GbDFR2启动子的激活作用；⑥qRT-PCR检测基因表达水平（银杏以GbGAPDH为内参，拟南芥以AtPP2A为内参）。样本来源：银杏材料取自荆州长江大学银杏园38年生嫁接‘家佛手’树，于2025年3月11日至6月26日每15天采集不同发育阶段组织。

**研究结果**
3.1 GbMYB15的分离与分析：研究人员基于转录组数据筛选到基因evm.TU.chr9.19，经BLAST注释为GbMYB15。编码序列1275 bp，编码424个氨基酸，预测等电点5.28。启动子含干旱响应、激素响应、厌氧诱导、光响应及MYC结合位点等元件。蛋白含N端R2R3重复结构域（DNA结合域），R3亚域含bHLH互作基序[D/E]Lx₂[R/K]x₃Lx₆Lx₃R，C端含C1基序LIsrGIDPxT/SHRxI/L，以及MIXTA样特征基序AQWESARxxAExRLxRES，但缺乏C2抑制基序。
3.2 GbMYB15的亚细胞定位：生物信息学预测及共聚焦显微镜验证显示，GbMYB15-GFP融合蛋白荧光与核标记mCherry共定位，证实其为核定位转录因子。
3.3 GbMYB15在银杏不同组织及发育阶段的表达：qRT-PCR分析38年生银杏的叶、花、果、茎、根中GbMYB15表达与总黄酮含量。总黄酮在茎、果、雌球花、雄球花中随时间下降，叶片先降后升，雄球花含量最高。GbMYB15表达在叶和茎中先升后降，与黄酮呈负相关；在雄球花和雌球花中表达上升，也与黄酮负相关；但在果实中表达与黄酮同向下降（呈正相关），暗示可能存在反馈调控。根中表达极低或不可测。
3.4 GbMYB15表达与黄酮含量的相关性分析：100 μM ABA和1 mM MeJA处理银杏幼苗后，总黄酮含量均上升（MeJA在48 h达峰值约1.8倍，ABA在4 h约1.7倍），而GbMYB15表达总体呈相反趋势：MeJA处理下48 h时表达仅为对照的61%，ABA处理下表达在黄酮峰值时约为对照的50%，呈显著负相关。
3.5 GbMYB15蛋白与Gb34759蛋白互作：Y2H自激活检测显示BD-GbMYB15在含200 ng/mL AbA的SD/?Leu/?Trp/?His/?Ade/X-α-gal培养基上无自激活。筛选银杏文库得到互作序列Gb34759，编码二氢硫辛酰赖氨酸残基琥珀酰转移酶（OGDC-E2，三羧酸循环关键酶）。成对Y2H证实互作。BiFC显示cYFP-GbMYB15 + nYFP-Gb34759在核仁产生YFP信号，对照无信号。LCI显示共表达组LUC/REN比值显著高于空载体对照，证实两者在植物体内物理互作。
3.6 银杏中GbMYB15的瞬时过表达：在银杏叶片中瞬时过表达GbMYB15后，qPCR确认GbMYB15及互作基因Gb34759表达显著上升，总黄酮含量仅为对照的55.5%。单独过表达Gb34759使总黄酮降至60%。共过表达GbMYB15和Gb34759使总黄酮含量显著低于单独过表达组，表明两者协同增强负调控。
3.7 拟南芥中GbMYB15的过表达分析：通过花序浸染法获得三个T3代过表达株系（OE1、OE2、OE3），HPLC定量显示总黄酮含量分别为野生型（WT）的34.3%、39.6%、40.2%，显著降低，证实GbMYB15抑制拟南芥黄酮积累。
3.8 转基因拟南芥黄酮生物合成途径结构基因表达分析：qPCR结果显示，上游大部分*4CL*基因（除*At4CL8*）显著下调，*AtCHI*降低，*AtC4H*上调。*AtPAL3*上升，*AtPAL1*几乎不变，其余*PAL*下调。*AtCHS*和*AtCHSL3*下降，*AtCHSL1*和*AtCHSL2*上升。*AtF3H*上升，*AtF3'H*下降。下游黄酮醇途径中所有*AtFLS*基因显著受抑制（*AtFLS6*未检出），修饰基因*AtOMT*和*AtUGT73C6*显著下调。花青素/原花青素分支中*AtANR*显著下调，而*AtDFR*、*AtUFGT*、*AtLDOX*显著上调。
3.9 GbMYB15下游结构基因的鉴定：基于拟南芥中表达显著变化的家族基因（*AtC4H*、*AtF3H*、*AtDFR*、*AtFLS*、*AtLDOX*），在瞬时转化GbMYB15的银杏叶片中检测同源基因表达，发现*GbDFR2*变化最显著。双荧光素酶报告实验显示，SK-GbMYB15 + LUC-GbDFR2共转化组的LUC/REN比值显著高于三个对照组，表明GbMYB15可激活*GbDFR2*启动子活性，因此*GbDFR2*是其候选下游靶基因。

**讨论总结与结论翻译**
讨论部分指出，黄酮类化合物对植物生长发育和人类健康至关重要，其合成受结构基因和转录因子多层调控。R2R3-MYB蛋白N端保守，C端决定功能特异性，C1基序和C2（EAR）基序是转录抑制子的关键标识。GbMYB15仅含C1基序而缺乏C2基序，与已知负调控因子GbMYBR1相似，过表达后黄酮含量显著下降，因此初步判断其为负调控因子。
GbMYB15呈现组织特异性与发育阶段依赖性表达，启动子含多种激素和环境响应元件。干旱、光照、温度等环境因素可诱导黄酮合成，但过度或持续胁迫反而抑制。在果实组织中GbMYB15表达与黄酮含量呈正相关，可能原因包括上游因子级联调控、代谢物负反馈调节、转录因子特异性抑制分支途径、以及果实发育过程中代谢优先性转向初生代谢。
ABA和MeJA处理显著提升总黄酮含量，同时伴随GbMYB15表达显著下调，呈负相关，表明银杏可能通过抑制GbMYB15来解除负调控以应对胁迫。
过表达实验证实GbMYB15为总黄酮合成的负调控因子。Y2H筛选得到互作蛋白Gb34759（OGDC-E2，TCA循环关键酶），BiFC和LCI验证互作于核内。OGDC可能通过调控2-酮戊二酸水平影响依赖2-酮戊二酸的双加氧酶家族（F3H、FNS、FLS、ANS/LDOX），或通过提供碳源和能量影响苯丙烷途径，从而调节黄酮积累。Gb34759与GbMYB15互作可能增强负调控效应。
在拟南芥中过表达GbMYB15显著抑制黄酮醇途径基因（*AtFLS*、*AtOMT*、*AtUGT73C6*），同时上调花青素途径基因（*AtDFR*、*AtUFGT*、*AtLDOX*），推测GbMYB15通过增加底物进入花青素途径、减少进入黄酮醇途径来抑制总黄酮积累。双荧光素酶实验证实GbMYB15激活*GbDFR2*启动子，支持该模型。这种黄酮醇与花青素的权衡关系常见于植物。
基于此，研究人员提出调控模型：GbMYB15可能通过调控候选下游基因*GbDFR2*影响流向黄酮和花青素途径的能量与底物分配，从而间接影响总黄酮含量，Gb34759的互作进一步增强该效应。该模型仍需靶向代谢物分析及更多途径实验验证。
负调控机制可能具有生理适应性意义：防止黄酮过度积累导致的生长抑制、种子发育异常及生长素极性运输受阻，同时将碳资源重新导向初生能量代谢，确保活跃组织生长时优先利用光合产物。

**结论部分翻译**：MYBs在调控植物次生代谢中发挥关键作用，但其功能网络仍未完全阐明。本研究鉴定了一个功能独特的R2R3-MYB转录因子GbMYB15，它作为总黄酮生物合成的抑制因子。GbMYB15可能通过调控候选下游基因GbDFR2，调节黄酮和花青素生物合成途径中能量与底物的分配，从而间接影响总黄酮含量。此外，Gb34759与GbMYB15的互作可能进一步增强该调控效应。本研究为理解黄酮生物合成的负调控提供了实验和表型证据；然而，具体机制、与下游靶基因的直接结合以及对代谢流的调控仍需进一步验证。这些结果表明银杏中黄酮生物合成是一个整合转录和代谢调控的复杂网络，并为未来通过基因工程提高银杏黄酮含量提供了潜在的关键靶点和理论基础。