梅（Prunus mume）P型ATP酶基因家族的泛基因组分析及PmAHA3在有机酸积累中的功能表征

《Plant Physiology and Biochemistry》：Pan-genome Analysis of the P-type ATPase Gene Family in Prunus mume and Functional Characterization of PmAHA3 in Organic Acid Accumulation

　　

有机酸积累是决定梅（Prunus mume）果实风味和加工品质的关键因素，但其潜在分子机制仍知之甚少。P型ATP酶（ATPases）是一类膜蛋白，通过三磷酸腺苷（ATP）水解驱动离子和分子的主动转运，并在有机酸积累中发挥重要作用。然而，其在梅中的全基因组特征及功能仍缺乏系统认识。研究人员基于梅泛基因组鉴定出49个P型ATP酶基因，其中包括29个核心基因、6个近核心基因、11个可变基因和3个特有基因，并将其划分为6个亚家族。分散复制和全基因组复制（WGD）是驱动该基因家族扩张的主要力量，且大多数基因经历了强烈的负选择。表达谱分析鉴定出P3A型基因PmAHA3在果实中高表达，并定位于液泡膜。果实瞬时RNA干扰（RNAi）沉默和愈伤组织中CRISPR/Cas9敲除均显著降低了苹果酸和柠檬酸含量，证明其在有机酸积累中的作用。这些结果为理解P型ATP酶的进化与功能提供了新见解，并为改良果实品质提供了潜在靶标。

该研究发表于《Plant Physiology and Biochemistry》，聚焦梅（Prunus mume）果实酸味形成这一重要品质性状，围绕P型ATP酶（P-type ATPase）基因家族的进化组成与功能分化展开系统研究。梅果实以柠檬酸为主导的有机酸组成而具有鲜明风味特征，苹果酸在发育前期积累较多，而柠檬酸在后期逐渐成为主要成分；二者合计占总有机酸的99%以上。因此，解析果实有机酸积累的分子基础，不仅关系到风味形成机制的理解，也直接服务于果实加工品质与分子育种。然而，尽管P型ATP酶已在多种植物中被证明参与H⁺、Ca²⁺及脂质等跨膜运输，并与液泡酸化、花青苷呈色、逆境响应和有机酸积累密切相关，但其在梅中的成员组成、变异格局、表达特征及关键功能基因尚不清楚。基于此，研究人员利用泛基因组框架，对梅P型ATP酶家族进行了全景式解析，并重点鉴定与果实有机酸积累相关的候选基因PmAHA3，进而通过亚细胞定位和功能缺失实验验证其生物学作用。研究表明，梅P型ATP酶家族总体上高度保守，但同时存在明显的结构与存在/缺失变异；其中PmAHA3是一个液泡膜相关的H⁺-ATP酶，在苹果酸和柠檬酸积累中发挥正调控作用。该研究为理解蔷薇科果树有机酸调控机制及梅品质改良提供了重要理论基础与候选基因资源。

在技术方法上，研究人员首先基于10份梅种质材料构建基因水平泛基因组，并结合隐马尔可夫模型（HMM）、系统发育分析、共线性分析、Ka/Ks选择压力分析、结构变异（SV）、单核苷酸多态性（SNP）与插入缺失（InDel）注释，对P型ATP酶家族进行鉴定与进化分析。随后整合多组织、果实发育阶段及逆境处理的RNA-seq数据开展表达谱分析，并以‘浙江珍珠梅’和‘木瓜梅’等材料为样本来源，结合qRT-PCR、高效液相色谱（HPLC）、烟草瞬时表达亚细胞定位、果实瞬时RNAi沉默和愈伤组织CRISPR/Cas9敲除，对PmAHA3进行功能验证。

在研究结果部分，论文首先在“Pan genome-wide identification and classification of P-type ATPase in P. mume”中完成了梅P型ATP酶基因家族的泛基因组鉴定。研究人员经过严格筛选，最终确定49个保守P型ATP酶基因，并依据拟南芥（Arabidopsis thaliana）同源基因关系将其划分为PⅠB、PⅡA、PⅡB、PⅢA、PⅣ和PⅤ六个亚家族。其中PⅡB亚家族成员最多，而PⅡA和PⅤ成员最少。进一步的存在/缺失变异（PAV）分析将其分为29个核心基因、6个近核心基因、11个可变基因和3个特有基因，表明该家族既具有维持基本生命活动所需的高度保守成员，也包含可能与种质特异性适应和性状分化相关的可变成员。结合有机酸含量数据进行相关分析后，部分基因的PAV状态与苹果酸或柠檬酸水平显示出相关性，提示家族内的基因存在/缺失变异可能参与果实酸度差异形成。

在“Structural and conserved motif analyses of the P-type ATPase genes”部分，研究人员系统分析了基因结构、跨膜结构域与保守基序。结果显示，不同成员的外显子数从1到34不等，结构差异显著，尤以PⅡB亚家族最为突出。基于系统发育关系和外显子—内含子组织，PⅡB进一步被划分为S1、S2、S3三个亚群，其中S3成员通常仅含1—2个外显子，呈现显著的内含子简化；S2成员则具有更复杂的结构。这说明该亚家族可能在保持核心催化功能的同时经历了不同方向的结构重塑。保守基序分析表明，多数成员保留完整的关键基序，尤其是包含经典磷酸化特征序列DKTG的基序2几乎普遍存在，说明其ATP依赖性磷酸化催化核心高度保守。跨膜结构域预测则显示，大多数蛋白具有8—10个跨膜螺旋，支持其典型膜转运蛋白特征。

在“Structural variation analysis of P-type ATPase genes in P. mume”部分，研究人员分析了P型ATP酶相关的结构变异及小变异分布。结果发现，结构变异主要位于上游、内含子、基因间区和下游区域，未检测到位于外显子的结构变异；SNP和InDel也主要富集于基因间区，发生在编码区的比例很低。这说明P型ATP酶编码序列受到较强功能约束，而家族多样性更可能通过启动子和其他非编码调控区变异来实现。对PmACA2和PmACA3启动子区域的进一步比较发现了重复区变异与72 bp缺失，为其潜在转录调控差异提供了直接证据。

在“Collinearity and duplication analysis of P-type ATPase genes in 10 P. mume varieties”与“Evolutionary selection pressure on P-type ATPase genes revealed by Ka/Ks analysis across ten P. mume varieties”两部分中，研究人员从家族扩张机制与进化选择角度进行了分析。结果显示，在泛基因组水平上，分散复制和全基因组复制（WGD）是推动该家族扩张的主要动力；而在10个梅基因组中，几乎所有P型ATP酶基因都与WGD/片段复制有关，说明该家族在物种演化过程中总体保持较高共线性和保守性。Ka/Ks分析进一步表明，大多数基因的Ka/Ks值小于1，提示其主要受到负选择，只有少数基因在特定种质中表现出Ka/Ks>1，暗示存在谱系特异性的适应性分化。

在“Protein properties of P-type ATPases in P. mume”部分，研究人员比较了不同亚家族蛋白的分子量、理论等电点（pI）、不稳定指数（II）和平均疏水性（GRAVY）等理化性质。结果显示，该家族在蛋白理化参数上具有明显异质性，特别是PⅡB亚家族分布最为分散，提示其可能定位于不同细胞膜系统并承担多样化运输功能。这一结果与其在结构和表达上的分化趋势相一致。

在“Expression profiling of P-type ATPase genes in different tissues and fruit development stages of P. mume”部分，研究人员整合多组织、果实发育和逆境转录组数据，发现高表达基因主要集中于PⅢA亚家族。PmAHA1和PmAHA9在芽中表达较高，而PmACA7呈根特异表达。更重要的是，在果实发育过程中，PmAHA1、PmAHA3和PmAHA8均表现出较高转录丰度，其中PmAHA3在两个品种多个发育时期中始终维持最高表达，并呈现明显的果实偏好表达模式。由于PmAHA3与已知调控柑橘和矮牵牛液泡酸化及柠檬酸积累的PH5具有较高同源性，因此被确定为关键候选基因。逆境表达分析还发现，一些P型ATP酶成员响应低温或盐胁迫，说明家族内部存在明显功能分工。

在“Subcellular localization of PmAHA3”部分，研究人员通过烟草（Nicotiana benthamiana）叶片瞬时表达体系，对PmAHA3进行亚细胞定位。由于全长载体构建存在技术困难，研究采用PmAHA3 N端片段与EGFP融合，并以AtTPK-mCherry作为液泡膜标记。共聚焦观察显示，PmAHA3-N-EGFP信号与液泡膜标记高度重叠，说明PmAHA3定位于液泡膜。这一结果与其作为H⁺泵参与液泡酸化和有机酸积累的推定功能相吻合。

在“CRISPR/Cas9 knockout of PmAHA3 in P. mume and its effect on organic acid accumulation”部分，研究人员在‘木瓜梅’愈伤组织中利用CRISPR/Cas9构建PmAHA3敲除材料。测序结果表明，靶位点发生了5 bp缺失并导致移码和提前终止，属于明确的功能缺失突变。对潜在脱靶位点的检测未发现编辑事件，说明编辑特异性较高。功能测定显示，与对照相比，PmAHA3敲除愈伤组织中的苹果酸和柠檬酸含量均显著下降，证明PmAHA3对两种主要有机酸积累具有正向调控作用。

在“Transient silencing of PmAHA3 in P. mume fruit”部分，研究人员进一步在发育中的梅果实中实施RNAi瞬时沉默实验。GUS染色验证了注射侵染成功，qRT-PCR结果显示PmAHA3表达量显著下降。与此对应，沉默PmAHA3后果实中的苹果酸和柠檬酸含量均显著降低。该结果与愈伤组织CRISPR/Cas9敲除结果相互印证，进一步确认PmAHA3在果实有机酸贮存中的关键作用。

讨论部分强调，泛基因组策略相比单一参考基因组更全面地揭示了梅P型ATP酶家族的组成，特别是识别出可变基因和特有基因，有助于理解种内遗传多样性及性状分化基础。研究认为，该家族虽然整体保守，但在PⅡB亚家族中出现显著的外显子—内含子结构分化，并伴随表达模式差异，提示结构重塑可能与功能分化相关。大量变异位于非编码区而非编码区，结合Ka/Ks普遍小于1的结果，说明该家族的进化分化更可能通过调控层面的变化实现，而非通过改变核心蛋白结构。对于PmAHA3，表达、定位以及双重功能缺失证据共同支持其作为液泡膜H⁺-ATP酶参与有机酸积累，但论文也指出，其直接介导液泡酸化的机制仍需通过液泡pH和H⁺-ATPase活性测定进一步验证。总体而言，该研究不仅拓展了对梅P型ATP酶家族演化规律的认识，也为果实酸度分子调控及品质育种提供了重要候选靶标。

研究结论部分可概括为：本研究对梅P型ATP酶基因家族开展了系统的泛基因组分析，共鉴定49个成员，并将其划分为6个亚家族。基因结构、保守基序和跨膜结构域分析表明，各亚家族之间存在明显结构多样性，但催化核心基序，尤其是P型ATP酶磷酸化特征序列DKTG，高度保守。结构变异分析显示，大多数变异位于调控区而非编码区，提示转录调控差异可能推动该家族功能分化。进化分析表明，该家族总体高度保守，主要受到负选择。表达谱分析鉴定PmAHA3为果实优势表达基因。通过愈伤组织CRISPR/Cas9敲除和果实瞬时RNAi沉默实验，研究人员证明PmAHA3受损会显著降低苹果酸和柠檬酸积累，说明其在液泡质子转运和果实有机酸积累中发挥重要作用。整体而言，该研究为阐明P型ATP酶的进化特征与功能角色提供了新认识，并为梅果实品质改良提供了潜在遗传靶标。