《Plant Physiology and Biochemistry》：PagWRKY40 transcription factor improved insect resistance of Populus alba ×P. glandulosa
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森林病虫害对树木的生长、发育和产量产生严重影响。为应对昆虫侵扰，树木进化出了复杂且相互关联的调控途径以诱导植物防御反应。代谢物如茉莉酸（JA）和类黄酮在植物防御昆虫中发挥重要作用。本研究中，研究人员发现一个属于WRKY IIa亚组的转录因子PagWRKY40定
森林病虫害对树木的生长、发育和产量产生严重影响。为应对昆虫侵扰，树木进化出了复杂且相互关联的调控途径以诱导植物防御反应。代谢物如茉莉酸（JA）和类黄酮在植物防御昆虫中发挥重要作用。本研究中，研究人员发现一个属于WRKY IIa亚组的转录因子PagWRKY40定位于细胞核。昆虫取食实验表明，PagWRKY40在84K杨（Populus alba×Populus glandulosa）中的过表达可通过减少取食量、提高过氧化氢酶（CAT）、脂氧合酶（LOX）、多酚氧化酶（PPO）活性以及提升茉莉酸（JA）和类黄酮含量，来增强对美国白蛾（Hyphantria cunea）的抗性。RNA-seq分析表明，PagWRKY40过表达（PagWRKY40-OE）植株与野生型（WT）植株之间的差异表达基因（DEGs）显著富集于氧化酶活性以及苯丙烷和类黄酮等代谢物的生物合成途径。此外，PagWRKY40可直接结合到PagLOX3、PagCHI和PagPAL3启动子上的W-box元件，以调控茉莉酸（JA）和类黄酮的生物合成，从而增强84K杨对美国白蛾的抗性。总之，这些结果表明PagWRKY40是一个正向调控植物昆虫抗性防御的转录因子，可为未来新型抗虫林木品种的选育提供候选种质资源，并为阐明植物昆虫抗性防御机制奠定基础。
**论文解读**
**研究背景与问题**
森林病虫害严重威胁树木的生长、发育和产量。为应对植食性昆虫的侵害，植物在长期进化中形成了复杂的防御机制，包括组成型防御和诱导型防御，其中诱导型防御又涉及直接防御（如产生防御性代谢物和蛋白）和间接防御。在昆虫取食引发的早期信号事件中，钙离子内流、活性氧（ROS）爆发及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应被激活，进而诱导植物激素如茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和乙烯（ET）的生物合成，最终导致防御相关基因上调表达和防御化合物积累。苯丙烷类化合物及其衍生物类黄酮在植物抗虫中发挥关键作用，脂氧合酶（LOX）途径产物和萜类也是防御应答的重要组成部分。WRKY转录因子家族（尤其是IIa亚组成员）在植物生物胁迫响应中具有调控功能，但相关研究多集中于草本植物，木本植物中WRKY转录因子的功能与机制仍需深入探索。美国白蛾（Hyphantria cunea）是一种世界性检疫害虫，寄主范围广，对农林资源安全构成严重威胁。84K杨（Populus alba×P. glandulosa）生长快、适应性强，是林木分子生物学模式材料，但易受美国白蛾侵害。因此，培育抗虫转基因84K杨是防控该害虫的重要策略。本研究旨在通过分子生物学和转基因方法探究PagWRKY40在84K杨抗虫防御中的功能及其调控机制，为选育新型抗虫林木品种提供候选种质资源。该论文发表在《Plant Physiology and Biochemistry》。
**主要关键技术方法**
研究人员选用84K杨（Populus alba×P. glandulosa）作为实验材料，美国白蛾（Hyphantria cunea）幼虫来自中国林业科学研究院，幼虫培养于吉林农业大学外来害虫研究基地。主要技术方法包括：RT-qPCR分析基因表达模式；亚细胞定位（GFP融合蛋白瞬时转化烟草）；转录激活活性分析（酵母Y2H系统）；农杆菌介导的叶盘法遗传转化获得过表达PagWRKY40的84K杨植株；昆虫取食实验测定幼虫增重率和叶片取食率；生理指标检测（CAT、LOX、PPO活性及JA、类黄酮含量）；转录组测序（RNA-seq）分析差异表达基因（DEGs）（样本来自WT和三个转基因株系，正常和处理条件各三个生物学重复，测序由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成）；GUS染色和活性检测；酵母单杂交（Y1H）验证蛋白与DNA结合；双荧光素酶报告实验验证转录调控关系。
**研究结果**
**2.1. PagWRKY40基因序列特征**：通过序列比对和系统进化分析，研究人员确认PagWRKY40含有完整的WRKY结构域（WRKYGQK）和典型的C2H2锌指基序，与AtWRKY40同源性最高，属于WRKY IIa亚组。
**2.2. PagWRKY40表达分析**：RT-qPCR显示PagWRKY40在叶片中表达显著高于根和茎；随着美国白蛾幼虫取食时间延长，其表达水平逐渐升高，于24 h达峰值；MeJA处理3 h后表达量升至对照约10倍；GUS染色和活性测定表明MeJA可激活PagWRKY40启动子。表明PagWRKY40可能参与生物胁迫和JA胁迫应答。
**2.3. 亚细胞定位和转录激活活性分析**：亚细胞定位显示PagWRKY40-GFP融合蛋白荧光仅定位于细胞核，表明其为核定位蛋白；酵母转录激活实验表明PagWRKY40无转录激活活性。
**2.4. 昆虫取食实验分析**：与野生型（WT）相比，过表达PagWRKY40（OE）株系叶片上美国白蛾幼虫的增重率显著降低（8 h时分别降低58.73%、54.52%、44.39%），叶片取食率也显著下降（降低30.78%-47.16%），表明PagWRKY40过表达增强了84K杨对美国白蛾的抗性。
**2.5. 生理指标测定**：正常条件下OE和WT植株的PPO、LOX、CAT活性及JA、类黄酮含量无显著差异；美国白蛾取食12 h后，OE植株中这些酶的活性和代谢物含量开始升高，24 h时显著高于WT，表明PagWRKY40通过提高上述生理指标增强抗虫性。
**2.6. 过表达PagWRKY40的84K杨转录组分析**：正常条件下OE与WT间有531个DEGs（234上调、297下调），取食处理后增至3427个（1153上调、2274下调），其中196个为共有DEGs。GO富集显示正常条件下氧化还原酶活性显著富集，取食后防御反应、类黄酮合成、谷胱甘肽氧化还原酶活性、脂肪酸代谢等GO term显著富集。KEGG富集显示正常条件下次级代谢物生物合成、MAPK信号通路、苯丙烷生物合成等通路富集，取食后类黄酮生物合成、苯丙烷生物合成、MAPK信号通路、植物激素信号转导、脂肪酸生物合成等通路显著富集，表明PagWRKY40可能通过JA和类黄酮生物合成调控抗虫性。
**2.7. PagWRKY40结合PagLOX3、PagPAL3和PagCHI启动子区域**：RT-qPCR显示OE株系中PagLOX3、PagLOX6、Pag4CL1、PagPAL3和PagCHI的表达显著升高。酵母单杂交（Y1H）表明PagWRKY40可结合W-box元件；顺式作用元件分析显示这些靶基因启动子上存在W-box；进一步Y1H证实PagWRKY40通过W-box结合PagLOX3-P2、PagPAL3和PagCHI启动子片段。双荧光素酶实验表明PagWRKY40可激活PagLOX3、PagCHI和PagPAL3启动子驱动的荧光素酶表达，证明PagWRKY40可直接调控这些基因。
**讨论部分总结**
讨论部分指出，PagWRKY40作为IIa亚组成员，与AtWRKY40同源性最高，其表达受取食和MeJA诱导，且过表达后提高LOX、PPO、CAT活性及JA和类黄酮含量，从而增强抗虫性。转录组分析揭示取食后大量DEGs富集于类黄酮和苯丙烷生物合成等通路。Y1H和双荧光素酶实验证实PagWRKY40可直接结合PagLOX3、PagCHI和PagPAL3启动子，促进JA和类黄酮积累。尽管PagWRKY40无转录激活活性，但可能通过与其他共激活因子互作或形成转录活性复合体实现调控，具体机制有待进一步研究。
**研究结论翻译**
本研究中，PagWRKY40是一个核定位蛋白，无转录激活活性，其表达可被美国白蛾取食显著诱导。过表达PagWRKY40增强了对美国白蛾的抗性。对其调控机制进行了分析（图8）。结果表明，PagWRKY40可通过W-box元件直接结合到PagLOX3、PagCHI和PagPAL3的启动子区域，从而促进茉莉酸（JA）和类黄酮的积累，增强昆虫抗性。这些发现为未来抗虫林木品种的选育和筛选提供了理论基础。
