百合中抗Lily bulb virus-1（LbV-1）基因的鉴定与功能验证：基于sRNA测序和转录组分析的见解

《Plant Science》：Identification and functional verification of resistance genes against Lily bulb virus-1 (LbV-1) in Lilium: insight from sRNA sequencing and transcriptomic profiling

　　

Nisar Uddin|Xia Li|Noor Muhammad|Muhammad Shahid|Adil Hussain|Lili Zhang|Daochen Zhu

中国江苏省镇江市，江苏大学环境与安全工程学院应急管理学院生物燃料研究所合成生物学与生物质生物精炼国际联合实验室，邮编212013

摘要

百合属是一种具有经济价值的植物，广泛用于观赏和商业用途。在本研究中，我们报道了一种新型线粒体病毒（命名为Lily Bulb Virus-1，简称LbV-1）的鉴定与特征分析，该病毒在商业百合鳞茎中被发现。这种病毒属于与百合作物相关的线粒体RNA病毒群中尚未被描述的成员。通过对50个商业栽培的百合鳞茎（包括Lilium longiflorum品种）的调查，发现其中一个品种感染了LbV-1，表明在测试条件下其感染率虽然较低但仍然可检测到。尽管受感染植物在体外培养过程中没有表现出可见症状，但通过PCR扩增、小RNA（sRNA）测序、透射电子显微镜（TEM）和机械接种实验确认了LbV-1的存在。共鉴定出9,122,220个独特的小RNA序列，其中21–22个核苷酸的序列与LbV-1基因组相匹配，这支持了病毒与宿主之间的活跃相互作用。此外，基于转录组的分析表明病毒可通过鳞茎有效传播，后代植物的感染率高达45%。对受感染和健康鳞茎的比较转录组分析产生了超过3000万个高质量读段，组装出3,671,770个转录本和168,004个单基因，平均长度为1,445个核苷酸。差异表达分析确定了8个候选基因（Li-PCP、Li-DUF、Li-UBD、Li-FRC、Li-CF、Li-APD、Li1-UN和Li7-UN），这些基因在LbV-1感染后显著上调，并通过RT-qPCR在三个发育阶段得到了验证。功能分析表明，当这些基因在易感百合植物中表达时，能够增强植物的抗病毒能力。这些发现为LbV-1的分子生物学、传播动态和宿主防御反应提供了新的见解。本研究强调了系统筛查商业百合鳞茎的重要性，以防止潜在病毒感染的传播，从而保障百合生产的可持续性。

这些发现对于商业栽培和植物表现具有重要意义。

引言

许多科学研究都集中在百合（Lilium）上，这是一种属于单子叶植物百合科的多年生草本植物，在全球园艺中发挥着重要作用（Chen等人，2023年）。百合容易受到多种病毒感染的侵袭，包括百合无症状病毒（LSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和百合斑驳病毒（LMoV），这些病毒对百合鳞茎的栽培构成了重大威胁，感染率可能高达98.6%（Chen等人，2023年；Zhang等人，2018年）。传统的视觉检测方法常用于评估由鳞茎传播的疾病（Rong等人，2011年）。然而，最近的发展带来了基于DNA序列的方法，用于检测受感染植物中的病原体，这些方法具有更高的准确性和可靠性。此外，全转录组测序技术被广泛用于揭示病毒感染后的全基因组基因表达变化。这些创新方法还可以揭示其他未知生物实体的存在，从而提供潜在未知感染和污染的线索（Fang等人，2022年；Orr等人，2020年；Sun等人，2022年）。病毒在自然界中普遍存在，对农业生产构成重大威胁，尤其是在病毒未被识别或从已知菌株进化出变异株的情况下（Manzoor等人，2023年；Tatineni和Hein，2023年）。病毒经常存在于植物中，尤其是在种子、鳞茎和其他繁殖器官中。大量研究表明，病毒感染可导致作物出现疾病症状，从而改变植物的形态、生理和产量（Sena等人，2024年）。然而，在自然环境中，也存在无症状的携带者植物，它们不会表现出明显的疾病症状（Manzoor等人，2023年）。尽管酶联免疫吸附测定（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）和微阵列等技术很有价值，但它们依赖于对潜在病原体的先验知识或序列数据，这限制了它们发现和分离新病毒的效果（Arora等人，2022年；Shukla等人，2023年；Uddin等人，2024年）。

最近，出现了一种有效的病毒发现方法，该方法利用高通量小RNA（sRNA）测序，特别是用于识别植物和动物病毒（Shakir等人，2023年；Villamor等人，2019年；Vivek等人，2020年）。这种方法通过自动富集宿主体内的病毒来源siRNA来实现，这些siRNA可以通过深度测序宿主sRNA轻松检测到（Valli等人，2023年；Zhang等人，2022年）。与传统方法不同，sRNA测序技术不需要预先知道病毒序列，也不需要培养和纯化病毒（Zhang等人，2022年）。植物对病毒感染的抵抗力通过相互关联的分子途径实现，主要涉及RNA沉默、激素信号传导和转录调控。RNA沉默是核心的抗病毒防御机制，其中Dicer样酶将病毒的双链RNA中间体处理成病毒来源的小干扰RNA（vsiRNAs）。这些vsiRNAs随后被整合到Argonaute复合体中，引导对病毒RNA的序列特异性降解。同时，激素介导的途径——特别是涉及水杨酸和茉莉酸的途径——调节系统性的防御反应，而转录因子如WRKY、MYB和bZIP则调节下游防御基因的表达（Sicard等人，2018年）。使用小RNA测序进行病毒鉴定和转录组分析以发现抗性基因，在机制上与宿主的抗病毒反应相关联。vsiRNAs的检测不仅能够可靠地识别活跃复制的病毒，还能反映宿主RNA沉默机制的激活。病毒感染通常会引发广泛的转录重编程，包括防御相关基因和途径的上调。因此，基于转录组的方法提供了一种稳健且生物学上合理的策略，用于捕捉这些宿主反应并识别与抗病毒防御相关的候选抗性基因（Sicard等人，2018年）。这一综合框架将病毒发现与抗性基因筛选联系起来，提供了关于宿主-病毒相互作用的诊断和功能见解。

此外，与通过基因组或RNA测序检测病毒的方法相比，sRNA分析方法能够以序列独立的方式识别新病毒，从而提供关于病毒生物学的见解（Zheng等人，2017年）。线粒体病毒通常具有约2.3–3.6 kb的基因组，编码一个依赖RNA的RNA聚合酶，并仅利用宿主的转录机制在宿主线粒体内复制（Zerbini等人，2023年）。与传统植物病毒不同，它们没有真正的病毒颗粒结构，而是以裸露的RNA分子形式存在。线粒体病毒的系统分类主要基于保守的RdRp序列（Li等人，2023年）。在本研究中，我们对表现出病毒样症状的进口百合进行了PCR和sRNA-seq分析，以研究新型LbV-1的存在和特征。为了识别潜在的抗性机制，我们进行了转录组分析，这有助于发现参与宿主对LbV-1防御的基因。在感染的多个阶段进行了从头转录组分析，从而比较了受感染和健康鳞茎中八个关键抗性基因的表达。我们的发现为理解百合对LbV-1的抗性提供了机制上的见解，从而增强了目前对百合栽培中病毒病害管理的认识。这些结果为进一步探索病毒-宿主相互作用和LbV-1感染的分子机制奠定了基础。

章节片段

材料与方法

实验材料使用了市售的Lilium longiflorum品种。共筛选了50个鳞茎以检测病毒感染。这些鳞茎在受控条件下进行体外培养，以确保生长的一致性和可重复性。通过聚合酶链反应（PCR）、小RNA（sRNA）测序、透射电子显微镜（TEM）和机械接种来评估LbV-1的感染情况。在测试的品种中，有一个品种被确认为阳性。

LbV-1病毒的检测、鉴定和接种

最初在中国江苏大学的温室中培养了一些疑似携带病毒样疾病的百合鳞茎以及外观健康的鳞茎。对表现出病毒样症状的受感染植物的鳞茎和叶片进行了PCR检测，以确认病毒的存在（图2a）。确认疾病后，通过用病毒感染植物的汁液擦拭健康植物的叶片来进行接种。

讨论

小RNA测序技术的发展显著提高了我们对全生物体的理解（González-Pech等人，2024年），全生物体不仅包括主要生物体，还包括其相关的微生物群落。与线粒体病毒不同，小RNA测序能够识别研究系统中未预见和先前未被识别的生物体和生物因子（Kasthuri等人，2023年；Ponath等人，2024年），尤其是在病毒方面。

结论

本研究鉴定并描述了LbV-1，这是一种之前未报道的与百合鳞茎相关的病毒，表明其可能广泛存在并通过鳞茎传播。sRNA测序和转录组分析支持将其归类为一个独立的病毒物种，并扩展了目前对百合相关病毒多样性的理解，这对观赏和园艺系统具有重要意义。然而，无法确定是否存在其他共感染的病毒。

CRediT作者贡献声明

Noor Muhammad：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、软件使用、数据分析。Xia Li：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、数据分析。Adil Hussain：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件使用、方法学研究、数据分析、概念化。Muhammad Shahid：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、验证、研究、数据分析、数据分析。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFC3403600）、江苏省重点研发计划（项目编号BE2021691）、江苏省碳中和创新计划（BK20220003）以及中国苏州科技大学水处理技术与材料协同创新中心的支持（地址：苏州，邮编215009）。

利益冲突

作者声明没有已知的利益冲突。