综述：二烯丙基二硫化物通过涉及CsBBM2-CsYUC6转录调控的生长素生物合成促进黄瓜根伸长

《Plant Physiology and Biochemistry》：Diallyl disulfide promotes root elongation through auxin biosynthesis involving the CsBBM2-CsYUC6 transcriptional regulation in cucumber

　　

大蒜与黄瓜间作是一种有效的农艺措施，可减轻连作系统中的土壤病害。大蒜根系分泌物二烯丙基二硫化物(diallyl disulfide, DADS)促进黄瓜根伸长，但其分子机制尚不清楚。在此，研究人员发现1 mM DADS通过刺激细胞扩张促进黄瓜主根伸长。激素定量结合外源生长素(auxin)施用和药理学抑制实验表明，DADS诱导的根伸长依赖于生长素。转录组和加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)鉴定出一个关键的生长素生物合成基因CsYUC6（受DADS上调）及其上游转录调控因子CsBBM2。电泳迁移变动(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和双荧光素酶(dual-luciferase, Dual-LUC)实验证实，CsBBM2通过直接结合CsYUC6启动子，作为其转录抑制因子。研究结果表明，DADS通过下调生长素生物合成基因CsYUC6的转录抑制因子CsBBM2，从而提高黄瓜根中的生长素(auxin)水平，促进根生长。这一结果为黄瓜-大蒜间作提供了机制性见解，并支持DADS作为可持续农用化学品的潜在应用。

1. 引言
化感作用是植物释放特殊代谢产物影响邻近生物生长和发育的普遍生物学现象。在农业中，化感作物被积极用于杂草抑制、减轻连作障碍和促进作物生长。大蒜(Allium sativum L.)广泛用于与黄瓜、番茄、辣椒、草莓和烟草等作物的轮作和间作系统，以提高土壤肥力、减少病虫害、缓解土传病害并提升土地利用效率和经济效益。大蒜根系分泌物中的二烯丙基二硫化物(diallyl disulfide, DADS)是主要的有机硫化物，具有抗氧化、抗炎、抗真菌、抗病毒、抗菌和解毒等多种生物活性。研究表明，DADS对番茄和黄瓜幼苗根伸长呈剂量依赖性影响，低浓度促进而高浓度抑制。在番茄中，DADS通过改变细胞分裂、内源植物激素(phytohormone)水平和扩展蛋白(expansin)基因表达来调节根生长。在黄瓜中，低浓度DADS通过上调CDKA和CDKB基因表达并调节激素平衡促进主根伸长。然而，DADS调控根伸长的精确分子机制仍需阐明。植物激素生长素(auxin)在调节根生长中起关键作用，其空间分布由生物合成、运输、感知和信号传导协调决定。吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)是最丰富的天然生长素，主要通过色氨酸(tryptophan, Trp)经两步IPyA途径合成，其中TAA1/TAR酶将Trp转化为吲哚-3-丙酮酸(indole-3-pyruvic acid, IPA)，再由YUCCA(YUC)家族酶氧化为IAA。YUC家族蛋白在根中表达，如水稻中YUC8调节根伸长。生长素运输由AUX/LAX家族转运蛋白介导流入，PIN-FORMED(PIN)和ATP结合盒亚家族B(ABCB/PGP)蛋白控制流出，TWISTED DWARF1(TWD1)作为伴侣正调控ABCB介导的生长素外排。下游信号涉及SCF^TIR1/AFB泛素连接酶复合体、Aux/IAA转录抑制因子和ARF转录因子的核模块，以及通过ABP1/ABL3-TMK1的快速细胞表面途径直接调节PIN转运蛋白。研究表明DADS处理诱导黄瓜和番茄根中生长素积累，转录组分析显示这与生长素生物合成基因表达改变相关，但DADS感知与这些基因转录重编程之间的具体分子级联仍未知。黄瓜是全球重要的蔬菜作物，但连作常导致土传病害和产量损失。大蒜-黄瓜间作已被证明是缓解连作障碍的有效策略。本研究通过激素定量、药理学实验、转录组学、加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)以及电泳迁移变动(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)和双荧光素酶(dual-luciferase, Dual-LUC)实验，揭示了DADS通过下调CsBBM2解除对CsYUC6的转录抑制，从而促进IAA介导的根伸长的机理。

3. 结果
3.1 DADS显著诱导黄瓜幼苗主根伸长
用不同浓度DADS处理黄瓜种子4天，低浓度(0.2、0.5、1.0 mM)显著促进主根伸长，高浓度(2.0、5.0、10 mM)则显著抑制，其中1 mM DADS促进作用最明显。1 mM DADS处理下，第1天主根伸长无显著差异，从第2天起显著促进，第3天差异最大。石蜡切片显示，与对照相比，DADS处理根伸长区皮层细胞长度显著增加，宽度不变，细胞面积增大，而细胞数量减少，表明1 mM DADS主要通过促进细胞扩张而非细胞分裂来增强主根伸长。

3.2 DADS通过IAA途径促进黄瓜主根伸长
激素定量分析显示，DADS处理后第1天和第3天，仅生长素IAA水平持续升高，且累积模式与根伸长正相关。外源IAA处理显著促进主根伸长。使用IAA生物合成抑制剂yucasin和运输抑制剂TIBA均抑制主根伸长，但随后施加IAA可恢复伸长。同样，yucasin或TIBA预处理的种子再接触DADS，主根伸长也得到恢复，且在yucasin抑制的根中恢复更明显。这些结果表明DADS通过促进IAA积累来促进黄瓜主根伸长。

3.3 转录组分析
对DADS处理1小时和12小时的根进行转录组测序，获得高质量数据。差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)分析显示各比较组分别有2928、1854、1569和2463个DEGs。GO富集分析在生物过程、分子功能和细胞组分中分别富集了代谢过程、催化活性和膜等条目。KEGG通路富集主要在全球概述图和信号转导。qRT-PCR验证15个随机DEGs，RNA-seq与qRT-PCR数据相关性高(R²=0.8023)。由于IAA途径参与，分析1小时DEGs发现IAA生物合成基因YUCCA6(CsYUC6, CsGy2G022220)显著上调，qRT-PCR证实其表达在0.5小时被诱导，12小时达峰。此外，生长素运输基因PIN4(CsGy5G010140)和响应因子ARF4(CsGy6G015850)、ARF3(CsGy6G034510)也差异表达。

3.4 鉴定调控CsYUC6的关键转录因子
对3770个DEGs进行WGCNA，筛选软阈值β=13，鉴定出14个共表达模块。蓝色模块与IAA含量正相关(r=0.89, P<0.01)，绿色(r=-0.76, P<0.01)和暗灰色(r=-0.79, P<0.01)模块负相关。蓝色模块表达模式与持续IAA累积不一致，而绿色和暗灰色模块在DADS处理下表达持续降低，因此聚焦这两个模块。提取CsYUC6启动子2000 bp序列预测转录因子(transcription factor, TF)结合位点，获得32个预测TF的106个结合位点。将这些预测TF与RNA-seq差异表达TF及绿色和暗灰色模块基因取交集，获得两个候选TF：CsDOF3.4(CsGy6G027220)和CsBBM2(CsGy2G008180)。qRT-PCR显示CsBBM2在DADS处理1小时后下调更显著。

3.5 CsBBM2直接抑制CsYUC6转录
生物信息学预测CsBBM2和CsDOF3.4在CsYUC6启动子上的结合位点分别位于-515 bp和-517 bp。双荧光素酶实验显示，共表达35S:CsBBM2效应载体与CsYUC6启动子驱动的LUC报告载体显著降低LUC/REN比值，而35S:CsDOF3.4无影响，表明CsBBM2抑制CsYUC6启动子转录活性。EMSA实验显示，含预测结合位点的寡核苷酸探针与重组CsBBM2蛋白形成特异性DNA-蛋白复合物，过量未标记探针竞争结合，突变探针无法形成复合物，证明CsBBM2直接结合CsYUC6启动子。保守结构域分析显示CsBBM2属于AP2/ERF家族的AP2亚家族，含两个保守AP2结构域(氨基酸263-335和365-429)。亚细胞定位实验表明CsBBM2-GFP融合蛋白定位于细胞核。

4. 讨论
本研究证实1 mM DADS促进黄瓜主根伸长，且IAA生物合成途径在其中起核心作用。DADS处理显著提高内源IAA水平，外源IAA类似促进根伸长，而抑制IAA生物合成或运输则抑制伸长，且DADS可逆转这些抑制效应。石蜡切片显示DADS处理增加伸长区细胞长度，这是生长素介导的生长促进的典型细胞表型。转录组鉴定出CsYUC6上调，与激素变化一致。尽管GA₃、ABA等其他激素也有变化，但IAA起主要作用。DADS对根伸长呈剂量依赖性，与IAA浓度依赖性效应一致。WGCNA结合启动子预测和实验验证，确定CsBBM2为直接结合CsYUC6启动子并抑制其表达的转录抑制因子。CsBBM2属于AP2家族，与植物体细胞胚胎发生和根发育相关。本研究提出工作模型：对照条件下，CsBBM2抑制CsYUC6表达维持基础IAA水平；DADS处理下调CsBBM2，解除对CsYUC6的抑制，促进IAA合成，进而刺激根伸长。该结果揭示了DADS的作用机制，为可持续农业应用提供理论基础。