脂质组成对膜结合CYP2J2热性质及功能性质的差异性影响

《Protein Science》：Differential effects of lipid composition on the thermal and functional properties of membrane associated CYP2J2

　　

摘要：CYP2J2是一种膜结合细胞色素P450（cytochrome P450，CYP），表达于心肌细胞，可将花生四烯酸代谢为具有心脏保护作用的环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）。其跨膜结构域嵌入细胞膜疏水区并被多种脂质包围。目前对于特定脂质在介导CYP2J2理化性质中的作用及其调控因素尚缺乏深入了解。本研究将CYP2J2重构至含有不同脂质组成的纳米盘（Nanodisc）中，脂质选取参照内质网（endoplasmic reticulum，ER）膜组成。研究人员联合使用纳米差示扫描荧光法（Nano-Differential Scanning Fluorimetry，nano-DSF）与紫外–可见光谱（UV–Visible Spectroscopy）证明：CYP2J2在去垢剂胶束与纳米盘环境中的解折叠行为存在差异，第一个熔解转变对应血红素（heme）微环境扰动。此外，改变脂质环境可使第一和第二熔解转变温度（melting transition temperature，Tm1、Tm2）分别偏移达3–4°C和8–9°C，其中含鞘磷脂（sphingomyelin，SM）和含POPS（1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphoserine）的纳米盘分别表现出最高和最低的热稳定性。脂质组成对底物（ebastine，依巴斯汀）结合亲和力无影响；但NADPH氧化速率显示脂质组成通过改变CYP与其氧化还原伴侣细胞色素P450还原酶（Cytochrome P450 Reductase，CPR）间的电子传递速率直接调控CYP2J2在纳米盘中的功能。研究人员还使用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）荧光各向异性表征含胆固醇和鞘磷脂纳米盘的膜流动性（membrane fluidity）。结果表明，脂质组成直接调控纳米盘中CYP2J2的热稳定性和功能特性，脂质头基电荷与膜流动性是脂质组成发挥此种效应的关键因素。

论文解读：脂质组成对膜结合CYP2J2热性质及功能性质的影响

CYP2J2是主要表达于心肌细胞的内质网膜结合细胞色素P450酶，负责将花生四烯酸代谢为具有心血管保护作用的环氧二十碳三烯酸（EETs），参与调控心血管健康、炎症及血管生成，并与高血压和肿瘤进展相关。膜蛋白的结构与功能受周围脂质环境的直接影响，脂质不仅可与蛋白质形成特异性相互作用，还能调节膜流动性与堆积有序度。虽然已有研究表明脂质对其它膜蛋白具重要调节作用，但特定脂质如何调控P450酶——特别是CYP2J2——的热稳定性与催化功能，及其背后的物理化学机制尚不清楚。既往生物物理研究常使用去垢剂胶束模拟膜环境，但去垢剂会损害膜蛋白的结构与功能完整性；纳米盘（Nanodisc，由膜支架蛋白Membrane Scaffold Protein，MSP包裹磷脂双分子层构成）可更好地模拟天然脂质双层环境。因此，研究人员选用模拟内质网（ER）及抗去垢剂膜微域（Detergent-Resistant Micelles，DRMs）组成的多种脂质配方，将CYP2J2重构入纳米盘，系统探究脂质组成对其热稳定性和功能特性的影响，并阐明脂质头基电荷与膜流动性在其中的作用。该论文发表于《Protein Science》。

主要关键技术方法

研究人员将N端截短并带C端五聚His标签的CYP2J2与分子伴侣GroEL/ES共表达后纯化；使用色氨酸突变为苯丙氨酸的"暗"MSP1D1（dark MSP1D1）制备14种不同脂质组成的纳米盘并载入CYP2J2，经尺寸排阻色谱纯化。采用纳米差示扫描荧光法（nano-DSF，Prometheus NT.48，激发280 nm，检测330 nm与350 nm荧光，以F₃₅₀/F₃₃₀一阶导数确定熔解温度T_m1和T_m2）；紫外–可见分光光度法测定A₃₆₀/A₄₁₇比值评估热诱导血红素（heme）微环境扰动，并进行Ferrous–CO结合实验检测P450（λ_max≈450 nm）向失活P420（λ_max≈420 nm）形式的转化；底物依巴斯汀（ebastine）结合通过Type I自旋位移紫外差谱计算解离常数K_d；NADPH氧化 assay监测340 nm吸光度下降计算CYP2J2–CPR复合体电子传递速率；荧光偏振（Fluorescence Polarization，FP）法使用DPH探针表征纳米盘膜流动性（偏振度与流动性负相关）。

研究结果

2.1 CYP2J2在不同脂质组成纳米盘中的重构（Reconstitution of CYP2J2 into nanodiscs of different lipid composition）

研究人员以POPC（1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine）为基底脂质，构建含不同比例POPS（1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphoserine）、POPE（1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphoethanolamine）、胆固醇（cholesterol，CH）及鞘磷脂（sphingomyelin，SM）的二元或多元脂质体系，包括模拟天然ER膜（70% POPC/1% POPS/20% POPE/5% CH/4% SM）和DRM（45% POPC/2% POPS/18% POPE/23% CH/12% SM）组成。CYP2J2与dark MSP组装后经Superdex 200尺寸排阻色谱获得单一对称洗脱峰，SDS-PAGE显示约57 kDa（CYP2J2）与~23 kDa（dark MSP1D1）两条带，证实成功重构。

2.2 去垢剂胶束与纳米盘中CYP2J2热解折叠行为的差异（Difference in thermal unfolding of CYP2J2 in detergent versus nanodisc）

去垢剂（0.1% 胆酸盐，cholate）中CYP2J2的nano-DSF一阶导数图显示三个转变峰（~50°C、~60°C、~75°C）；而纳入纳米盘后，~60°C中间峰减弱并与~75°C峰合并，仅保留~50°C（Peak 1）和~75°C（Peak 3）两个主导转变，表明脂双层环境改变了CYP2J2的解折叠路径与协同性。

2.3 第一熔解转变对应血红素（heme）解离/微环境扰动（The first melting transition corresponds to heme dissociation）

天然ER脂质组成纳米盘中CYP2J2随温度升高，A₃₆₀/A₄₁₇比值在~50°C附近急剧上升，提示heme从活性中心解离或配位微环境被破坏。Ferrous–CO差示光谱显示：25°C时以P450特征峰（~450 nm）为主；50°C（第一熔解转变前）出现部分P420（~420 nm），P450占70.8%、P420占29.2%；加热超过第一熔解温度（60°C及75°C）后P450完全消失，100%转化为失活P420形式。证明第一热转变（T_{m）伴随Cys硫醇盐配位破坏及heme微环境崩解。}

2.4 脂质组成影响纳米盘中CYP2J2的热稳定性（Lipid composition affects thermal stability of CYP2J2 in nanodisc）

nano-DSF显示：随POPS比例从0%增至30%，T_m1从51.70±0.3°C降至48.9±0.4°C，T_m2从73.60±0.2°C降至67.90±0.7°C，带负电头基降低热稳定性。POPE与CH增加亦致T_m轻微下降，且T_m2峰变宽或分叉。相反，SM含量增加（5%→10%）使T_m1升至52.40±0.2°C，T_m2升至76.56±0.2°C。含SM纳米盘热稳定性最高，含30% POPS最低；T_m1最大差异约3–4°C，T_m2最大差异达8–9°C（10% SM vs 30% POPS），说明脂质组成尤其是SM的有序堆积可显著提升CYP2J2热稳定性。

2.5 脂质组成通过改变CYP与CPR间电子传递速率影响CYP2J2功能（Lipid composition affects the function of CYP2J2 in nanodisc by altering the rate of electron transfer between CYP-CPR）

NADPH氧化速率反映CPR→CYP2J2电子传递效率。随POPS比例升高电子传递速率递增，30% POPS纳米盘速率最高；POPE和CH比例升高亦使速率略升；而SM比例升高则速率递减，10% SM纳米盘速率最低。热稳定性与电子传递速率呈反向关系：POPS去稳定但促电子传递（负电头基利于CYP–CPR静电结合），SM稳定但抑制电子传递（低膜流动性限制蛋白侧向扩散与构象调整）。

2.6 脂质组成不影响CYP2J2的底物结合（Lipid composition does not affect the substrate binding to CYP2J2 in nanodisc）

以ebastine为底物进行紫外差谱结合实验，不同脂质组成纳米盘（含30% POPS、30% POPE、25% CH、10% SM及Native ER）所得K_d值均在4–7 μM范围（如Native ER为6.78±0.30 μM，去垢剂胶束中为7.2±0.53 μM），无显著差异，表明脂质环境不改变CYP2J2活性中心对底物的亲和性，功能差异源于电子传递步骤而非底物结合。

2.7 脂质组成改变膜流动性（Lipid composition changes the fluidity of the membrane）

DPH荧光偏振结果显示：SM增多→偏振度升高→膜流动性降低（SM饱和酰链紧密堆积）；CH增多→偏振度降低→膜流动性升高。膜流动性与CYP2J2–CPR电子传递速率正相关——较高流动性促进二者侧向碰撞与瞬时结合，较低流动性（高SM）限制此过程，从而将脂质对功能的影响关联至膜物理属性。

讨论与结论总结

研究人员指出CYP2J2在去垢剂与纳米盘中解折叠行为不同，纳米盘脂双层抑制中间(~60°C)转变使其解折叠更趋双态协同，符合膜整合对结构域热力学耦合的调控。第一熔解转变(T_m1≈50°C)对应用于heme–Cys硫醇配位丢失及P450→P420转化。脂质头基电荷影响热稳定性与功能：负电POPS削弱热稳定性但因静电吸引促进CPR结合及电子传递；SM通过提升脂质堆积有序度和降低膜流动性提高热稳定性但减缓电子传递。POPE与CH也通过微调膜性质产生中度效应。底物结合不受脂质组成影响，说明脂质专一性调控氧化还原伴侣交互及催化周转。结论为：脂质组成通过脂质头基电荷与膜流动性双重机制直接调制纳米盘中CYP2J2的热稳定性和功能特性（电子传递速率），强调在膜蛋白研究与纳米盘药物递送体系中还原生理相关脂质环境的重要性。