《Poultry Science》：The causative mutation for muffs and beard phenotype correlates with gene expression profile in chicken embryonic brains: an RNA-seq analysis
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鸡27号染色体上的一种复杂结构变异是鸡颊须和胡须（muffs and beard，Mb）表型的致病突变。Mb变异区段包含多个对神经系统发育具有重要意义基因的拷贝数变异（copy number variation，CNV），其中包括HOXB8、HOXB7和SMA
鸡27号染色体上的一种复杂结构变异是鸡颊须和胡须（muffs and beard，Mb）表型的致病突变。Mb变异区段包含多个对神经系统发育具有重要意义基因的拷贝数变异（copy number variation，CNV），其中包括HOXB8、HOXB7和SMARCE1。然而，此前尚不清楚该区段内基因是否在脑组织中表达，或是否会影响神经发育。本研究采集了北京油鸡Mb型与非Mb型个体在不同发育时点的胚胎脑组织。逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）结果显示，SMARCD2、HOXB8、SMARCE1和KRT222在Mb鸡脑组织中高表达。HOXB8在胚胎第15天后表现出稳定的差异表达，且在全部差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）中倍数变化最大。对胚胎第19天脑组织进行RNA测序（RNA-seq）表明，DEGs富集于神经发育相关过程，如突触组装、信号转导、化学性突触传递以及神经递质调控。多种关键神经发育基因亦表现出差异表达，为发育差异提供了生物学依据。神经递质分析进一步显示，谷氨酸和γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）水平存在显著差异。作为神经发育的重要调控因子，HOXB8在脑切片中呈广泛mRNA表达，尤其在皮层组织中更为明显，且其蛋白序列在进化上高度保守。在鸡胚原代脑细胞中，HOXB8过表达可显著调控多个神经发育相关基因，包括AGT、SLC32A1、SLC18A2、RPS20、RPL35A、SLC6A11和RLN3。总之，本研究首次表明Mb区段内基因在鸡胚脑组织中高表达，并介导神经发育相关基因表达及神经递质含量差异，其中HOXB8是关键候选基因。这些发现为Mb变异参与神经发育研究开辟了新方向，未来仍需进一步探究Mb鸡的神经学与行为学差异。
该文发表于《Poultry Science》，聚焦鸡颊须和胡须（Mb）表型相关结构变异在神经发育中的潜在作用。既往研究已确认Mb位点的复杂结构变异是该羽毛表型的致因基础，且HOXB8是调控下颌与面部形态发生的核心基因，但该变异区段同时包含HOXB7、SMARCE1等与神经系统发育相关的基因，其在鸡胚脑中的表达特征及其是否影响脑发育，长期缺乏直接证据。作者注意到Mb鸡与非Mb鸡在行为表现上存在差异，因此有必要从胚胎发育阶段切入，明确Mb区段基因是否改变脑组织转录组、神经递质稳态及神经发育相关分子网络。
研究人员以同时包含Mb和非Mb个体的北京油鸡为材料，围绕胚胎脑发育开展了系统研究。结果显示，Mb区段内并非所有重复基因都在脑中稳定差异表达，真正表现最突出的是HOXB8。该基因自胚胎第15天起在Mb鸡脑组织中持续升高，到胚胎第19天差异最显著，并且在皮层、下丘脑、中脑、脑桥、延髓和小脑等多个脑区均显示高表达。与此一致，原位杂交证明HOXB8 mRNA在全脑广泛分布，在皮层区域信号尤为明显。转录组结果进一步表明，不同Mb基因型鸡胚脑之间存在一批与神经系统功能密切相关的差异表达基因，这些基因主要富集于突触组织、信号传递、化学性突触传递、神经递质水平调节、突触囊泡循环及神经活性配体-受体相互作用等过程，提示Mb变异不仅关联外部羽毛表型，也伴随胚胎脑内分子发育程序的改变。
研究采用的关键技术方法主要包括：以北京油鸡受精蛋为样本来源，先经多重PCR进行Mb基因分型；采集胚胎第11、13、15、17、19天脑组织开展RT-qPCR；对胚胎第19天左侧大脑皮层进行RNA-seq、GO/KEGG富集分析及谷氨酸、GABA含量测定；结合HOXB8原位杂交、跨物种系统发育与蛋白序列比对；最后在胚胎第15天原代脑细胞中过表达HOXB8并检测下游基因变化。
以下为研究结果的凝练解读。
“Analysis of Gene Expression Levels within the Mb Variant Region in Brain Tissues”
研究人员比较了Mb区段7个注释基因在不同胚胎时期脑组织中的表达。结果表明，SMARCD2、HOXB8、SMARCE1和KRT222在Mb鸡部分时期显著高表达，但只有HOXB8表现出最稳定、最持续且倍数差异最大的上调趋势。由此可见，Mb变异区段中的脑表达效应具有基因特异性，而HOXB8是其中最突出的候选调控因子。
“RNA-seq Analysis of Brains Between Mb and Non-Mb Chicken Embryos”
在胚胎第19天皮层组织中，Mb/Mb与mb/mb之间检测到110个差异表达基因，Mb/mb与mb/mb之间检测到147个，Mb/Mb与Mb/mb之间检测到730个。富集分析显示，这些差异基因主要涉及神经发育、突触功能和神经递质调控，尤以SLC家族与核糖体蛋白家族基因变化较为集中。该结果说明Mb位点相关变异与鸡胚脑内神经分子网络重塑密切相关。
“RT-qPCR validation of DEGs from RNA-seq”
研究人员选取RPS20、RPL35A、SLC32A1、SLC17A8、SLC6A11、AGT、AVP和RLN3等基因进行验证。除RPL35A在杂合子组中的变化与转录组不完全一致外，其余基因总体支持RNA-seq结果，说明测序获得的神经发育相关表达差异具有较高可信度。
“Differences in Neurotransmitter Levels Between Mb and mb Chickens”
在胚胎第19天，Mb鸡脑组织中GABA含量显著升高，而谷氨酸含量显著降低。由于二者分别代表主要抑制性和兴奋性神经递质，该结果提示Mb相关脑发育差异已不仅停留在转录层面，还进一步体现为神经化学水平的改变。
“In situ hybridization analysis of HOXB8 RNA in Brain”
原位杂交显示，HOXB8在非Mb鸡全脑中已有表达，但Mb鸡所有脑区信号更强，尤其皮层表达明显。这一证据从空间层面支持HOXB8在Mb鸡胚脑中广泛且增强的表达状态，为其作为关键调控基因提供了解剖学依据。
“Phylogenetic and Protein Sequence Alignment Analysis of HOXB8”
跨13个物种的比较表明，HOXB8蛋白虽存在鸟类与哺乳类的系统发育分支差异，但其Homeobox功能域高度保守，序列一致性极高。该结果提示HOXB8在不同物种中可能保留了核心调控功能，也增强了其参与鸡神经发育调控的合理性。
“HOXB8 Modulates the Expression of Neurodevelopment-related Genes”
研究人员在鸡胚原代脑细胞中建立HOXB8过表达模型后发现，HOXB8可显著调控多种神经发育相关基因，其中AGT、SLC32A1和SLC17A8上调，SMARCE1、KRT222、RPS20、RPL35A、SLC6A11和RLN3等下调。结合JASPAR转录因子结合位点分析，说明HOXB8具备调控下游神经发育基因网络的能力，不过其不能解释全部转录组差异，提示Mb区段内其他基因也可能共同参与调节。
讨论部分的核心在于：本研究首次将Mb表型相关结构变异与鸡胚脑神经发育联系起来。作者通过时间序列表达分析、转录组测序、神经递质检测与细胞功能实验，证明Mb区段内至少部分基因，尤其是HOXB8，在鸡胚脑中高表达，并与突触功能、神经递质运输及神经发育基因表达变化相关。与此同时，作者也指出HOXB8过表达实验与体内转录组结果并非完全一致，说明原代细胞体系、转录因子剂量效应以及细胞异质性可能影响结果解释；此外，HOXB7和SMARCE1等Mb区段基因的神经功能仍需继续验证。整体而言，论文未将行为差异作出超出证据范围的因果判定，而是将分子、神经递质与候选调控基因之间的联系建立为后续神经生物学研究的基础。
研究结论部分可译为：
总体而言，本研究系统比较了Mb鸡与非Mb鸡脑组织中的基因表达谱，首次证明Mb变异区段内的HOXB8、SMARCE1等基因在胚胎脑发育过程中存在差异表达。Mb区段基因在胚胎脑中的高表达，很可能导致神经发育相关基因表达改变及神经递质代谢变化。在Mb鸡中，HOXB8 mRNA广泛分布于全脑，且其核心功能结构域在物种间高度保守。此外，HOXB8在体外过表达可显著影响多个神经发育相关基因的表达，支持其作为神经发育重要调控因子的地位。未来仍需进一步开展围绕Mb鸡神经发育相关基因表达及行为学的研究。
