利用溶剂/洗涤剂处理减少真核病毒同时保留噬菌体组以实现更安全的粪便病毒组移植

《Poultry Science》：Reducing eukaryotic viruses while preserving the phageome to achieve a safer virome for fecal virome transplantation

　　

病毒组（virome）在维持宿主肠道健康方面发挥着重要作用。粪便病毒移植（fecal virome transplantation, FVT）作为一种新兴的治疗策略，在调控肠道微生态和治疗相关疾病方面展现出潜力。然而，FVT中存在的真核病毒（eukaryotic viruses）带来了潜在风险，可能危及该疗法的安全性与有效性。本研究利用噬菌体（bacteriophages, phages）与真核病毒之间的关键结构差异——即有无包膜（envelope）——通过溶剂/洗涤剂（solvent/detergent, S/D）处理降低样本中真核病毒的负荷，同时保留具有生物活性的噬菌体组（phageome）。为此，研究人员采集了健康AA肉鸡的粪便样本，分离病毒组并进行S/D处理。随后进行DNA病毒组测序分析，以评估该处理的影响。结果表明，S/D处理倾向于降低真核病毒科（如腺病毒科Adenoviridae、细小病毒科Parvoviridae）的相对丰度，而噬菌体仍保持为优势病毒组分。α多样性分析显示处理后整体病毒多样性无显著差异；然而，β多样性分析表明病毒群落组成发生偏移。进一步的差异病毒分析揭示，处理后特定噬菌体的相对丰度显著增加。最后，病毒组功能分析显示存在多种参与DNA代谢和宿主细胞壁重塑的基因。值得注意的是，FVT0与FVT1之间的主要功能区别在于FVT1中对真核病毒的响应减弱。综上所述，本研究表明S/D处理可降低FVT中真核病毒的丰度，从而提高临床安全性。这些发现为FVT在动物疾病治疗中的安全应用提供了理论基础和方法学支持，为更安全有效的病毒疗法开辟了新途径。

## 论文解读

### 一、研究背景与问题提出

肠道微生物群（gut microbiota）是由细菌、真菌、病毒、古菌及其他微生物实体组成的复杂微生态系统（Martinez et al., 2022）。该微生物群落的稳态对宿主健康至关重要，其功能涵盖促进高效消化吸收、调控代谢与免疫功能以及抵抗病原入侵等多个方面（Malik et al., 2025）。因此，恢复失调的微生物群已成为当前研究的重要焦点。在各种策略中，粪便微生物移植（fecal microbiota transplantation, FMT）是一种针对菌群失调相关疾病的有前景的治疗手段，旨在通过将健康供体的粪便材料转移至受体以恢复健康的微生物组成与功能（Ng et al., 2024）。

尽管FMT疗效确切且短期安全性良好，但其仍面临标准化不足及潜在不可预估的长期风险等重大挑战（Yu et al., 2023）。为解决可获得性与安全性问题，经过滤的粪便移植制剂——即粪便病毒移植（FVT）应运而生。FVT已在代谢综合征、2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）和肥胖等模型中展现出治疗潜力（Rasmussen et al., 2020; Manrique et al., 2021）。FVT通过无菌过滤去除FMT材料中的细菌和真菌，从而缓解病毒成分转移过程中的细菌移位等风险。肠道病毒组主要由噬菌体构成，占比约97.7%，因其调控细菌种群和影响宿主健康的潜力而成为FVT研究的主要焦点（Dalmasso et al., 2014; Wu et al., 2023）。虽然研究已对健康和疾病状态下的病毒组分进行了表征，但由于缺乏全面的噬菌体序列数据库，大多数哺乳动物肠道病毒组仍未被表征（Carding et al., 2017; Shkoporov et al., 2019; Zuo et al., 2019），这使其被描述为"病毒暗物质（viral dark matter）"。然而，FVT中也可能含有真核病毒和古菌病毒（Spencer et al., 2022）。尽管其中许多可能是共生的或无害的，但其在疾病发病机制中的潜在作用仍是值得关注的安全问题。

### 二、研究设计与核心思路

研究人员揭示了一个可用于提升FVT安全性的关键结构差异：大多数真核病毒具有包膜，而绝大多数噬菌体无包膜（Adriaenssens et al., 2020; Roux et al., 2023）。包膜病毒对溶剂和洗涤剂敏感，因此可通过S/D处理选择性灭活。基于此，研究人员以健康AA肉鸡来源的FVT制剂为处理对象，采用S/D方案进行处理，并通过比较处理前后的DNA病毒组测序谱来评估该方法实现选择性病毒灭活的可行性。

### 三、主要技术方法

样本来源方面，研究人员采集了3份复合粪便样本，每份样本由20只健康42日龄AA肉鸡的粪便混合而成。病毒组制备采用SM缓冲液均质、离心去 debris、0.45 μm膜过滤除菌、超滤浓缩（Centriprep Ultrafiltration YM-30K，截留分子量30 kDa）及0.22 μm终过滤的步骤获得原始FVT（FVT0）。S/D处理参照Mao等（2024）的方法，采用1%（w/v）三正丁基磷酸酯（tri(n-butyl) phosphate, TnBP）和1%（w/v）Triton X-100在30 °C处理4小时，随后用Amberlite XAD-7树脂去除残余试剂，经浓缩后获得S/D处理FVT（FVT1），整个实验独立重复三次。

DNA病毒组测序与分析方面，使用噬菌体DNA提取试剂盒提取基因组DNA后送至上海3D生物医学科技股份有限公司测序，原始数据由成都噬菌体时代生物科技有限公司进行综合分析。数据分析流程包括：使用fastp进行质量控制；Bowtie2比对鸡参考基因组去除宿主来源reads；MEGAHIT进行序列组装（≥1,000 bp）；采用VirSorter2、DeepVirFinder、VIBRANT和GenomeAD四种工具整合鉴定病毒序列；CheckV评估序列质量；基于平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）≥95%且覆盖度≥85%聚类为病毒操作分类单元（viral operational taxonomic units, vOTUs）；通过三级注释策略（ICTV MSL40.v1共聚类、vContact2病毒聚类分析、VITAP注释）进行分类注释；RPKM（Reads Per Kilobase Million）值定量。多样性分析采用phyloseq包计算Shannon、Simpson和Chao1指数，Wilcoxon秩和检验评估α多样性差异，主坐标分析（Principal Coordinate Analysis, PCoA）和置换多变量方差分析（permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA）评估β多样性。差异分析采用DESeq2（log₂ fold change ≥1，FDR<0.05）。功能注释使用HUMAnN3进行GO（Gene Ontology）和KO（KEGG Orthology）分析。

### 四、研究结果

**病毒组分类组成**：vOTU序列注释鉴定出1个界、7个门、9个纲、9个目、32个科、127个属和263个种。科水平上，病毒组主要由Steigviridae、Drexlerviridae、Straboviridae、Chaseviridae、Herelleviridae、Schitoviridae和Peduoviridae等噬菌体科组成。属水平上，Kuravirus、Carltongylesvirus、Gamaleyavirus、Saphexavirus等为主要组分。种水平上，Punavirus P1、Escherichia phage 04086、Escherichia phage PSD2001、Clostridium phage phiCD24-1等相对丰度较高。

**α多样性与β多样性分析**：Shannon指数和Simpson指数评估显示FVT0与FVT1在物种丰富度和均匀度上无显著差异（p>0.05）。Chao1指数估计FVT0略高于FVT1，但差异无统计学意义（p>0.05）。PCoA和NMDS分析揭示FVT0与FVT1之间存在轻微的组成差异，但同样无统计学显著性（p>0.05）。

**病毒丰度差异分析**：原核病毒（prokaryotic viruses）相对丰度在FVT0与FVT1之间无显著变化（p>0.05）；真核病毒（eukaryotic viruses）在FVT1中呈降低趋势，但差异无统计学意义（p>0.05）。科水平上，四个真核病毒科在FVT1中均较FVT0降低，依次为Adenoviridae、Parvoviridae、Poxviridae、Smicoviridae（p>0.05）。此外，Schitoviridae、Herelleviridae、Ackermannviridae、Aliceevansviridae、Demerecviridae和Microviridae等多个噬菌体科的相对丰度在FVT1中显著高于FVT0（p<0.05）。属水平上，Becedseptimavirus、Lederbergvirus、Sugarlandvirus、Svunavirus、Copernicusvirus和Jerseyvirus等噬菌体属显著增加（p<0.05）。种水平上，Microviridae sp、Klebsiella phage vB_Kpn_AM_K4、Flavonifractor phage Chenonceau、Escherichia phage 04086、Bacillus phage PK1_W、Eneladusvirus BF和Salmonella phage vB_SemP_Emek等肠道常见噬菌体显著增加（p<0.05）；而Punavirus P1、Clostridium phage phiCD24-1和Aerococcus phage vB_AviM_AVP显著减少（p<0.05）。

**GO与KO功能注释差异**：GO分析将功能术语分为分子功能（Molecular Function, MF）、生物学过程（Biological Process, BP）和细胞组分（Cellular Component, CC）三个主要领域。FVT0与FVT1的关键区别在于FVT1对真核病毒的响应减弱。MF领域鉴定出13种酶活性，包括溶菌酶（lysozyme，用于细菌细胞壁分解）、DNA聚合酶（DNA polymerase，用于DNA合成）、解旋酶（helicase，用于DNA解旋）、核酸酶（nuclease）和内切核酸酶（endonuclease）活性等。BP领域包括八个过程：DNA复制（DNA replication）和修复（repair）对维持遗传物质至关重要；DNA甲基化（DNA methylation）表观调控基因表达；DNA重组（DNA recombination）产生遗传多样性；肽聚糖分解代谢过程（peptidoglycan catabolic process）参与细菌细胞壁降解。CC领域注释到"膜的整合组分（integral component of membrane）"，提示膜相关蛋白或酶的存在。KO分析显示FVT0具有更高的酶和蛋白丰度，病毒编码的关键酶包括DNA聚合酶I（用于DNA合成/修复）、T偶数诱导脱氧核苷酸激酶（T-even-induced deoxynucleotide kinase）等，以及染色体分配蛋白（chromosome partitioning protein，用于病毒基因组分布）、Straboviridae RNA聚合酶σ因子（sigma factor）等蛋白质。

### 五、讨论与结论

研究人员在讨论部分系统阐述了研究的设计考量与结果意义。肠道微生物群在维持和调控宿主代谢与健康方面具有不可替代的作用，其中噬菌体作为原核病毒，是肠道病毒群落的主要成员，其在体内（包括肠道、口腔和皮肤）的丰度远超真核病毒（Keen and Dantas, 2018）。噬菌体在塑造细菌群落组成和功能方面发挥关键作用，如Hsu等（2019）发现噬菌体通过增加细菌或噬菌体群落内的功能多样性来影响细菌群落的组成和功能，并帮助维持肠道稳态。肠道中的真核病毒可能引起感染或保持潜伏，部分真核病毒如诺如病毒（norovirus）、轮状病毒（rotavirus）和星状病毒（astrovirus）已被证实与腹泻直接相关（Fulci et al., 2021）。

本研究应用S/D处理以选择性灭活包膜真核病毒。在设计及安全风险评估中，充分考虑了禽类特异性包膜致病病毒，包括禽流感病毒（avian influenza virus）、新城疫病毒（Newcastle disease virus）和传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus）。尽管这些病原体在健康肉鸡粪便样本中理论上无法检测到，但仍被归为威胁FVT生物安全的潜在生物危害。测序结果显示科水平上优势病毒科均为噬菌体相关分类群，属和种水平的深入分析进一步证实了相对较高丰度的噬菌体，这与先前FVT病毒组以噬菌体为主导的研究发现一致（Yu et al., 2023）。α多样性无显著差异，β多样性显示一定变异但无统计学显著性。然而，靶向分析揭示FVT1中噬菌体相对丰度显著增加（p<0.05），主要为常见肠道噬菌体，这支持了FVT在雏鸡肠道疾病治疗中的潜在应用。科水平上，FVT1中Baculoviridae、Nudiviridae和Adenoviridae等部分真核病毒科相对丰度略有降低，表明S/D处理倾向于降低FVT中真核病毒的相对丰度。但检测到某些噬菌体的轻微减少，这可能归因于S/D处理中吸附树脂表面功能基团与特定噬菌体之间的相互作用导致的不完全洗脱和回收效率降低（Lothert et al., 2020）。

功能分析显示病毒组富集于DNA复制、修复、甲基化、重组、包装和肽聚糖降解等生物学过程，这些是噬菌体生命周期的特征，提示病毒积极参与核酸代谢和宿主细胞壁重塑。GO术语涵盖多种酶活性，表明病毒在催化、翻译后修饰和感染过程中结构支持的潜在作用。KO分析进一步鉴定了病毒编码的关键酶和蛋白，包括DNA聚合酶I和III亚基等DNA复制核心组分，以及脱氧核苷酸激酶、DNA解旋酶和内切核酸酶等，与GO分析的分子功能注释相互印证。

FVT在临床动物疾病治疗中已显示积极效果：Borin等（2023）发现FVT可通过改变肠道微生物群影响瘦型和肥胖型小鼠的表型；Rasmussen等（2023）报道FVT促进肠道Akkermansia muciniphila增殖并意外提高实验小鼠的受精率；Feng等（2024）证明FVT以更温和的方式调控肠道微生物群结构并增强紧密连接蛋白表达；Wu等（2024发现FMT和FVT均可促进LPS诱导的肉鸡肠道损伤的炎症恢复，且FVT对肉鸡的不良刺激较小，可降低致病基因传播风险。随着细菌耐药性的全球升级，噬菌体疗法作为抗生素治疗细菌疾病的替代方案日益受到关注。然而，单一噬菌体有时难以达到理想的临床效果，而含有90%以上噬菌体集合的FVT则代表了细菌疾病的有效替代治疗（Raeisi et al., 2023）。

FVT中的真核病毒可能触发宿主免疫反应甚至引发疾病，尽管其数量相对较少，但在刺激宿主免疫反应方面更为有效（Seo and Kweon, 2019）。Mao等（2024）证明S/D处理的FVT可有效治疗小鼠艰难梭菌（Clostridium difficile）感染，与FMT和未处理FVT相比，S/D处理FVT降低了小鼠死亡率，8只接受治疗的 mice中7只粪便qPCR检测艰难梭菌呈阴性。本研究为FVT在动物疾病治疗中的应用提供了方法学基础，也为本研究制备的白羽肉鸡FVT治疗雏鸡沙门氏菌感染提供了有效参考。

研究承认存在以下局限性：仅进行了DNA病毒组测序，定量的是病毒核酸相对丰度而非完整病毒颗粒的功能感染性；S/D处理虽通过破坏脂质包膜灭活包膜病毒，但可能未完全降解病毒基因组DNA，导致核酸水平上的残留病毒负荷被高估；当前研究仅表征了DNA病毒而未分析RNA病毒，需进一步的宏转录组分析或RNA病毒组测序全面评估S/D处理对不同病毒类群的净化效率；严格的体内肉鸡动物模型验证对于确认S/D处理FVT在实际生产条件下的生物安全性至关重要，这将作为后续研究的优先方向。

**研究结论**：在本研究中，对鸡粪便病毒组进行S/D处理，倾向于降低真核病毒的相对丰度，同时保持噬菌体的活性和多样性。该方法可能提高粪便病毒移植的安全性，为其在动物疾病治疗中的临床应用提供理论基础和方法学支持。