探索I型黄酮类合成酶在阿皮吉宁（apigenin）合成中的作用

《Process Biochemistry》：Exploring the synthesis of apigenin by type I flavonoid synthase

　　

周家伟|王壮|郑江杰|何志科|董杰|郑毅|陈小龙

浙江工业大学生物技术与生物工程学院，中国杭州310014

摘要

芹菜素是一种天然存在的黄酮类化合物，具有显著的生物活性，但由于植物提取产率低以及自然资源有限的限制，其高效生产较为困难。为克服这一挑战，从Petroselinum crispum（PcFNSI）、Apium graveolens（AgFNSI）和Daucus carota（DcFNSI）中提取的三种I型黄酮合成酶（FNSI）被异源表达在大肠杆菌中，并系统评估了它们将柚皮苷转化为芹菜素的催化效率。其中，PcFNSI在大肠杆菌中的溶解性更好，且其芹菜素合成活性高于AgFNSI和DcFNSI。后续的应用研究表明，PcFNSI介导的芹菜素生产的最佳反应条件包括600 μM柚皮苷、5 mM α-酮戊二酸、0.5 mM Fe2?和1% DMSO。在这些条件下，柚皮苷的转化率可达80.4%，产率为130.34 mg/L芹菜素。值得注意的是，芹菜素/琥珀酸浓度、底物配置、添加策略或酶添加方法的变化对底物转化率没有显著影响。本研究建立了一种基于FNSI的优化反应系统，用于从柚皮苷合成芹菜素，并系统探讨了影响芹菜素生产的因素。这些发现为芹菜素及相关黄酮类化合物的大规模工业生产奠定了基础。

引言

芹菜素是一种源自欧芹和芹菜等植物的主要黄酮类化合物，具有广泛的药理活性，包括抗氧化[1]、抗菌[2]、抗病毒[3]、抗癌[4]、心血管保护[5]和神经保护作用[6]。这些特性推动了其在制药、食品和化妆品行业的广泛应用。然而，目前芹菜素的生产面临重大瓶颈。其主要来源——植物提取方法效率低下且劳动密集，因为产率极低（例如，芹菜中的产率约为0.338 mg/kg[7]），同时提取纯度存在挑战，植物材料也有限。尽管已经探索了化学合成途径[8]、[9]、[10]，但这些方法受到苛刻反应条件和有毒试剂使用的限制，限制了其工业生产的可行性。

植物中的芹菜素生物合成通过一个已建立的兩阶段途径进行[11]。第一阶段中，L-酪氨酸或L-苯丙氨酸在酪氨酸氨裂解酶（TAL）或苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）与肉桂酸羟化酶（C4H）的作用下转化为活化的4-香豆酰-CoA，随后由4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）进一步处理。第二阶段中，4-香豆酰-CoA与三个丙二酰-CoA分子在查尔酮合成酶（CHS）的催化下缩合生成查尔酮，查尔酮随后通过查尔酮异构酶（CHI）异构化为(2S-柚皮苷。最后，柚皮苷通过黄酮合成酶I（FNSI）或II（FNSII）氧化为芹菜素。尽管已在细菌、真菌和植物中进行了大量努力以异源生产芹菜素（表1），但所得产率仍不足以满足工业应用需求。微生物从头合成中的一个关键瓶颈是芹菜素本身的抗菌活性，这限制了宿主的存活。相比之下，生物催化合成提供了一种有前景的替代方案，可以规避这一毒性问题。此外，由于前体柚皮苷（或其糖苷形式）的自然丰富性，这种生物转化策略为工业生产芹菜素提供了实用且可扩展的途径。

虽然FNSI和FNSII都能催化柚皮苷向芹菜素的转化，但它们的作用机制不同。FNSI是一种依赖2-氧代戊二酸的双加氧酶（2-ODD），通过铁、氧气和辅助底物α-酮戊二酸的自由基机制进行氧化[12]、[13]。相比之下，FNSII是一种细胞色素P450单加氧酶，依靠血红素将一个氧原子插入底物中从而实现氧化。先前的研究表明，FNSI可以在大肠杆菌中以可溶且活性的形式表达[14]，其催化效率高于FNSII[14]。此外，由于CYP450酶是膜结合蛋白，在细菌中表达它们时需要细胞色素P450还原酶才能保持其活性，这带来了显著挑战。这些特性使得FNSI成为工业规模生物催化生产芹菜素的更有希望的候选酶。迄今为止，已在多种植物中发现了FNSI的同源物，包括Petroselinum crispum[15]、玉米[16]、Arabidopsis thaliana[16]、Daucus carota[17]和水稻[18]。然而，尚未有研究系统比较不同来源的FNSI酶的芹菜素合成能力，也未评估基于FNSI的体外酶促过程的工业可行性。

本研究系统评估了三种植物来源的FNSI酶在芹菜素合成中的潜力。通过在大肠杆菌中的异源表达和体外酶促实验，发现来自P. crispum的PcFNSI是Apium graveolens和D. carota来源的FNSI中最有效的催化剂。随后对PcFNSI反应系统进行了详细研究，以优化条件并阐明影响转化率的关键因素。最终，在确定的最佳条件下，柚皮苷的转化率从45%提高到80.4%，最终芹菜素的产率为130.34 mg/L。

章节片段

菌株、质粒和试剂

用于蛋白质表达的E. coli BL21(DE3)感受态细胞购自Tsingke Biotech（北京，中国）。编码PcFNSI（登录号：PQ177493）、DcFNSI（登录号：PQ177492）和AgFNSI（登录号：PQ177491）的密码子优化基因由GENEWIZ公司（苏州，中国）合成并插入pET28a载体中。芹菜素（纯度98%）、柚皮苷（纯度97%）购自Macklin（上海，中国）。肽粉、酵母提取物...

三种FNSI的可溶性表达和催化活性

FNSI最初在欧芹中被发现为一种可溶性酶，能够将黄烷酮转化为黄酮[21]。后续研究表明，FNSI可以在大肠杆菌中以可溶形式表达，并催化(2S-柚皮苷向芹菜素的转化[16]、[18]、[23]、[24]。然而，尚未报道不同FNSI异构体之间的可溶性表达效率的系统比较。在本研究中，来自P. crispum（PcFNSI）、A. graveolens（AgFNSI）和D.

结论

本研究系统评估了不同植物来源的I型黄酮合成酶在将柚皮苷转化为芹菜素方面的催化性能。在所检测的三种变体中，来自欧芹的PcFNSI在大肠杆菌中的可溶性表达最好，催化效率最高。值得注意的是，在高达1000 μM的芹菜素或副产物琥珀酸浓度下，未观察到产物抑制现象。然而，明显的底物抑制被确定为限制因素。

郑毅：数据分析、概念化。董杰：数据分析、概念化。陈小龙：撰写-审稿与编辑、项目管理、数据分析。周家伟：撰写-审稿与编辑、验证、研究、资金获取、数据分析。郑江杰：撰写-初稿、研究、数据分析、概念化。王壮：撰写-初稿、验证、研究、数据分析、概念化。

作者声明没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

本研究得到了浙江省自然科学基金（LQ22H280012）和中国国家自然科学基金（82104322）的支持。

作者声明没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。