《Process Biochemistry》：Metabolomic and Enzymatic Insights into Component Transformation and Bioactivity Enhancement in the Fermentation of Exocarpium Citri Grandis
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刘颖|秦雪玲|夏学森|张文科|张启民|潘涛|吴振强华南理工大学生物与生物工程学院，中国广州510006摘要本研究通过使用黑曲霉进行发酵，探讨了柑橘外果皮（ECG）功能特性的增强机制，并通过酶活性测定和非靶向代谢组学方法进行了分析。结果表明，黑曲霉分泌了一套复杂的酶系统，包括纤维素
刘颖|秦雪玲|夏学森|张文科|张启民|潘涛|吴振强
华南理工大学生物与生物工程学院，中国广州510006
摘要
本研究通过使用黑曲霉进行发酵，探讨了柑橘外果皮（ECG）功能特性的增强机制，并通过酶活性测定和非靶向代谢组学方法进行了分析。结果表明，黑曲霉分泌了一套复杂的酶系统，包括纤维素酶、果胶酶和β-葡萄糖苷酶，这些酶促进了细胞壁基质的降解以及黄酮类化合物的生物转化。代谢组学分析检测到870种差异代谢物，表明代谢途径发生了改变，初级营养物质（氨基酸和嘌呤）被消耗，可能支持了次级代谢物的生物合成。途径富集分析证实，黄酮类、黄酮醇和异黄酮类化合物的生物合成是关键调控途径。具体而言，如柚皮苷等苷类物质被转化为活性更高的苷元，包括柚皮素、山柰酚和木犀草素，这些苷元与抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的增强具有显著正相关。本研究为ECG的高值利用和基于发酵的功能食品的开发提供了潜在策略和实用方法。
引言
柑橘外果皮（ECG）来源于Citrus grandis‘Tomentosa’’和Citrus grandis（L.）Osbeck未成熟或接近成熟果实的外皮[1]，被正式认可为具有药用和食品双重用途的材料。传统上，ECG因其调节中医中的“气”（生命能量）、缓解咳嗽、化痰和促进消化的功效而受到重视[2]。现代药理学研究进一步验证了其多种生物活性，包括抗过敏、抗氧化、抗炎和降血糖作用[3]、[4]、[5]。然而，ECG的工业开发仅限于切片和干燥等初级加工。虽然这些物理处理方法保留了原材料的形态，但由于黄酮苷类（如柚皮苷）的高分子量和低脂溶性，人体难以直接吸收和利用它们[6]。同时，其强烈的苦味严重限制了其在现代食品工业中的应用[7]。相比之下，微生物分泌的胞外酶（如糖苷酶）在固态发酵（SSF）过程中特异性催化黄酮苷类脱糖，生成活性更高、苦味更低的苷元[7]、[8]。这不仅显著提高了生物利用度，还提升了感官品质，从而系统地克服了传统加工方法在保持形态的同时无法改变性质的瓶颈。
SSF作为一种具有操作简便性、环境友好性和成本效益的生物技术，已成为处理药用和可食用材料的有前景的方法[9]。Lin等人[10]通过协同发酵开发了一种具有独特果香和降低苦味的ECG红茶，但他们的研究侧重于工艺优化，而非阐明其背后的代谢机制。结晶曲霉已被证明能通过调节黄酮类和脂质代谢途径显著改变代谢谱型[11]，而酿酒酵母的发酵残渣通过抑制酪氨酸酶活性显示出美白潜力[12]。然而，这些研究要么侧重于感官改善，要么仅限于特定功能评估；没有将动态酶活性监测与代谢组学分析相结合，以系统阐明ECG发酵过程中的协同转化机制。
黑曲霉是一种通常被认为安全的丝状真菌，是纤维素酶、果胶酶和糖苷酶等酶的丰富生产者。这些酶在破坏植物细胞壁和催化黄酮苷类脱糖方面非常有效，使黑曲霉成为SSF的理想候选菌株[13]。本研究结合酶活性分析和非靶向代谢组学方法，探讨了黑曲霉发酵ECG过程中关键酶活性的动态变化，表征了发酵前后的代谢变化，确定了黄酮类化合物的生物转化途径，并建立了关键黄酮类代谢物与抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性之间的关联。通过提出“酶驱动的代谢转化、活性增强”的潜在协同机制，本研究为开发高质量的功能性ECG健康食品提供了技术参考。
章节摘录
菌株和试剂
黑曲霉（GDMCC 3.24）购自广东省微生物菌种保藏中心。ECG由广东惠州茶菊农业有限公司提供。标准物质（包括柚皮苷、柚皮素、rhoifolin和α-葡萄糖苷酶）分别从Macklin Biochemical（上海，中国）、Solarbio生命科学（北京，中国）、成都德赛特生物科技有限公司和源野生物科技有限公司（上海，中国）购买。色谱级甲醇
发酵过程中理化性质和生物活性成分的动态变化
如图1A所示，总糖含量在11天的发酵期间持续下降，从267.01 ± 3.90 mg/g显著降至131.81 ± 6.24 mg/g（p < 0.05）。这一50.63%的减少可能表明黑曲霉积极利用了ECG基质中的碳源进行生长和代谢[25]。有趣的是，还原糖含量呈现出先增加后减少的动态趋势，在第3天达到峰值145.29 ± 3.22 mg/g
结论
本研究通过整合动态酶活性分析和非靶向代谢组学，探讨了黑曲霉发酵ECG过程中的潜在生物转化机制。与以往仅关注单一成分或最终产物变化的发酵研究不同，本研究提出了“酶驱动的代谢转化、活性增强”的潜在机制：黑曲霉分泌了一套复杂的胞外酶系统
资助
本研究得到了国家自然科学基金（22366017）、江西省自然科学基金（20252BAC240313）、中国江门市科技创新平台建设资金（2021JK02402003）以及中国益维生物制造（江门）有限公司发展基金（2023Y1103011）的支持。
CRediT作者贡献声明
吴振强：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源提供。潘涛：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源提供、实验设计。张启民：验证、方法学设计、实验设计。张文科：验证、软件使用、实验设计。夏学森：撰写 – 审稿与编辑、软件使用、方法学设计。秦雪玲：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、实验设计、数据分析。刘颖：撰写 – 初稿撰写、方法学设计、实验设计、数据分析、数据整理
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
